Способы регуляции метаболической активности в клетке. Обмен веществ и энергии

ГЛАВА 8. РЕГУЛЯТОРНЫЕ СИСТЕМЫ У ПРОКАРИОТ

Регуляция жизнедеятельности прокариотных организмов происходит на разных уровнях (транскрипционном, трансляционном, метаболическом, поведенческом) и охватывает процессы, протекающие в одной клетке и в клеточной популяции.

РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА

До последнего времени основное внимание было уделено изучению регуляции клеточного метаболизма прокариот. Полученные данные дают ясное представление о том, что над метаболическими функциями клетки надстроена эффективная и сложная система регуляции.

В интактной клетке практически все протекающие метаболические процессы регулируются. Одна и та же реакция может одновременно подвергаться нескольким видам регуляторного воздействия, неравноценным по направлению и силе действия. Следствием этого является строгая координация активности отдельных метаболических процессов, приводящая к тому, что любой организм в норме представляет собой хорошо отлаженное устройство с системой развитых регуляторных связен. Эффективность клеточных регуляторных механизмов очень высока. Именно они обеспечивают максимально экономичное использование питательных веществ среды, предупреждают избыточный синтез промежуточных и конечных метаболитов, отвечают за быструю адаптацию к изменившимся условиям Следовательно, клетка в зависимости от конкретных условии должна быть способна уменьшить или увеличить скорость синтеза определенных метаболитов или скорость образования клеточной энергии.

Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций. Скорость последних может регулироваться двумя основными способами: путем изменения количества ферментов и/или изменения их активности, т. с. степени испольвания их каталитического потенциала.

Регуляция активности ферментов

Факторы, регулирующие активность ферментов, разнообразны по своей природе (). Физические факторы (температура, давление, свет, магнитное поле, электрические импульсы оказывают менее специфическое действие, чем химические. В свою очередь действие последних также может быть разделено на несколько типов. Одни химические вещества связываются с активным центром фермента, например субстраты, кофакторы, конкурентные ингибиторы, что приводит к изменению ферментативной активности. Другие вещества взаимодействуют со специальными участками на поверхности молекулы определенного типа фермента, не имеющими непосредственного отношения к центрам каталитической активности, но тем не менее приводящими к ее изменению.

Наконец, активность некоторых ферментов регулируется путем химической модификации их молекулы, в основе которой лежит ковалентное обратимое связывание с ферментом определенной группировки, что приводит к изменению его активности. У прокариот известны две ферментные системы, активность которых регулируется таким путем. Глутаминсинтетаза E. coli , катализирующая синтез глутамина, существует в двух формах, различающихся присутствием в одной из них остатка адениловой кислоты. Присоединение его с помощью ковалентной связи, катализируемое соответствующим модифицирующим ферментом, приводит к образованию менее активной аденилированной глутаминсинтетазы:

Удаление адениловой группы, ведущее к возникновению деаденилированной формы фермента, резко повышает его каталитическую активность. Аналогичный механизм регулирования активности фермента путем присоединения и удаления остатка уксусной кислоты (ацетилирование — деацетилирование) обнаружен для цитратлиазы у фотосинтезирующей бактерии Rhodopseudomonas gelatinosa . В этом случае активна ацетилированная форма фермента.

Наиболее быстрым, точным и тонким механизмом регуляции активности ферментов является регуляция, которой подвергается определенный тип ферментов, получивших название аллостерических 21 . Эти ферменты, как правило, занимают ключевые позиции в обмене веществ, располагаясь в "стратегических" пунктах клеточного метаболизма — начале метаболических путей или местах разветвлений, где расходятся или сходятся несколько путей.

21 Термин подчеркивает особенность данного типа фермента, заключающуюся в том, что вещества, регулирующие его активность, структурно отличаются от субстрата катализируемой им ферментативной реакции.

Аллостерические ферменты имеют каталитический и регуляторный (аллостерический) центры, пространственно разобщенные, но функционально тесно взаимосвязанные. Каталитическая активность фермента меняется в результате связывания с его регуляторным центром определенных метаболитов, называемых эффекторами. Кроме конечных продуктов данного пути, эффекторами могут быть субстраты ферментов, а также некоторые конечные продукты родственных метаболических путей. Если действие эффектора приводит к понижению каталитической активности фермента, такой эффектор называется отрицательным, или ингибитором. Положительным называют эффектор, действие которого повышает каталитическую активность фермента. Положительным эффектором, или активатором, чаще всего бывает субстрат данного фермента.

Связывание эффектора с регуляторным центром приводит к изменению сродства фермента к субстрату в результате какого-то конформационного изменения фермента ().

Наиболее простой случай аллостерической регуляции — регуляция первого фермента неразветвленного биосинтетического пути его конечным продуктом. Если конечный продукт накапливается в избытке, он подавляет активность первого фермента в процессе, называемом ингибированием по принципу обратной связи Примером такого типа регулирования является ингибирование биосинтеза L-изолейцина () Первый фермент на пути синтеза L-изолейцина L-треониндезаминаза является аллостерическим и ингибируется только L-изолейцином.

Для разветвленных путей биосинтеза (а к таким относится большинство биосинтетических путей) механизмы регуляции усложняются, так как от активности первого фермента зависит биосинтез нескольких конечных продуктов. Очевидно следующее: механизмы регулирования в этом случае должны быть видоизменены таким образом, чтобы перепроизводство одного конечного продукта не приводило к прекращению синтеза других связанных с ним конечных продуктов. Выработалось несколько механизмов контроля по принципу обратной связи применительно к разветвленным биосинтетическим путям. Они садятся к тому, что в этом случае в регулировании принимают участие нее конечные продукты этих путей. Если первый этап биосинтетического пути катализируется одним ферментом, на поверхности молекулы этого фермента имеются различные регуляторные центры, с каждым из которых связывается один из конечных продуктов, выполняющих функцию эффектора (). Некоторые аллостерические ферменты существуют в виде нескольких молекулярных форм (изоферментов). Изоферменты катализируют одну и ту же реакцию, но обладают разными регуляторными свойствами. Это связано с тем, что изоферменты имеют одинаковые каталитические, но разные регуляторныецентры. Каждый изофермент кодируется отдельным геном. Существование изоферментов позволяет конечным продуктам независимо друг от друга ингибировать активность определенного изофермента, так как каждый изофермент индивидуально контролируется "своим" конечным продуктом ().

Регуляция синтеза ферментов

Регулирование конечным продуктом активности аллостерического фермента определенного биосинтетического пути обеспечивает мгновенную реакцию, приводящую к изменению выхода этого продукта. Если последний оказывается ненужным, отпадает надобность и в ферментах, участвующих в его синтезе. Проявлением максимальной экономичности клеточного метаболизма служат выработанные клеткой механизмы, регулирующие ее ферментный состав. Очевидна целесообразность синтеза только тех ферментов, которые необходимы в конкретных условиях. Показано, что у прокариот в одних условиях фермент может содержаться в количестве не более 1 — 2 молекул, в других — составлять несколько процентов от клеточной массы.

Количество определенного фермента в клетке может регулироваться на нескольких уровнях: на этапе транскрипции, трансляции, а также в процессе сборки и разрушения ферментного белка (см. ). В иерархии регуляторных воздействий наиболее сложный механизм, контролирующий количество ферментов в клетке, связан с процессом транскрипции. Специфические химические сигналы могут инициировать или блокировать транскрипцию определенного участка ДНК в иРНК. В случае индукции образованная иРНК участвует в определенной последовательности реакций, называемой трансляцией и заканчивающейся синтезом полипептидных цепей. Регуляция белкового синтеза на уровне трансляции может осуществляться на любом из ее этапов, например на этапе инициации, элонгации и др. Не исключена также возможность изменения времени жизни иРНК. под воздействием разных эффекторов, в том числе конечных продуктов метаболических путей. Хотя механизмы регуляции синтеза белка на уровне трансляции еще точно не установлены, ясно, что на этом этапе имеются широкие возможности для регуляции скорости синтеза различных белков.

Известно, что фермент может выполнять метаболическую функцию после приобретения соответствующей структуры. Скорость образования структур высшего порядка также находится под контролем определенных молекул. Таким образом, контроль на уровне сборки функционально активного фермента может играть существенную роль в метаболической регуляции. Наконец, скорость разрушения фермента под воздействием специфических метаболических сигналов будет также определять его концентрацию в клетке.

Регуляция синтеза ферментов на этапе транскрипции основана на том, что "считывание" бактериальных генов происходит избирательно и скорость образования копий соответствующих иРНК (а отсюда и дальнейшая их трансляция в белки) находится под сложным контрольным механизмом. Скорость синтеза ферментов, определяемая этой стадией, может меняться в разной степени. По данному признаку все ферменты делятся на два класса. Ферменты, синтез которых в растущей клетке происходит с постоянной скоростью в результате постоянного транскрибирования соответствующих генов и, следовательно, они присутствуют в клетке в более или менее постоянной концентрации, называются конститутивными. К ним относятся, например, гликолитические ферменты. Метаболические пути, функционирующие с участием конститутивных ферментов, контролируются посредством других регуляторных воздействий, например аллостерического ингибирования.

Кроме этого в бактериальных клетках имеются ферменты, количества которых могут резко меняться в зависимости от состава питательных веществ среды. Это происходит в результате того, что гены, детерминирующие эти ферменты, включаются или выключаются по мере надобности. Их называют индуцибельными. При отсутствии в среде субстратов этих ферментов последние содержатся в клетке в следовых количествах. Если в среду добавить вещество, служащее субстратом определенного фермента, происходит быстрый синтез этого фермента в клетке, т. е. имеет место индукция синтеза фермента. Если же в питательной среде в готовом виде содержится вещество, являющееся конечным продуктом какого-либо биосинтетического пути, происходит быстрое прекращение синтеза ферментов этого пути. Это явление получило название репрессии конечным продуктом. Ферменты, синтез которых подавляется конечным продуктом, могут быть дерепрессированы, т. е. скорость их синтеза превысит обычную, если концентрация конечного продукта упадет до очень низкого уровня. Дерепрессия этих ферментов аналогична явлению индукции.

Репрессия конечным продуктом. Все биосинтетические пути находятся под контролем механизма репрессии конечным продуктом. Точно так же образование большинства анаболических ферментов регулируется путем репрессии их синтеза. Репрессия осуществляется особыми присутствующими в клетке веществами — репрессорами. Факторами, модифицирующими активность репрессоров, могут быть конечные продукты биосинтетических путей, а также промежуточные продукты некоторых катаболических или амфиболических путей.

Репрессия может быть координированной, т. е. синтез каждого фермента данного пути в одинаковой степени подавляется конечным продуктом. Часто синтез ферментов одного пути репрессируется в разной степени. В разветвленных биосинтетических путях механизмы репрессии могут быть модифицированы (как и механизмы ингибирования), чтобы лучше обеспечить регуляцию нескольких конечных продуктов из общего исходного субстрата. Синтез многих ферментов в таких путях репрессируется только при совместном действии всех конечных продуктов. Если реакция на общем участке разветвленного пути катализируется изоферментами, синтез каждого из них находится под контролем "своего" конечного продукта (см. ).

Механизм репрессии конечным продуктом на уровне транскрипции стал проясняться с 50-х гг. Большой вклад в это внесли работы Ф. Жакоба и Ж. Моно. Было показано, что наряду со структурными генами, кодирующими синтез ферментов, в бактериальном геноме существуют специальные регуляторные гены. Один из них — ген-регулятор (ген R), функция которого заключается в регуляции процесса транскрипции структурного гена (или генов). Ген-регулятор кодирует синтез специфического аллостерического белка-репрессора, имеющего два центра связывания: один узнает определенную последовательность нуклеотидов на участке ДНК, называемом оператором (ген О), другой — взаимодействует с эффектором. Ген-оператор расположен рядом со структурным геном (генами) и служит местом связывания репрессора. В отличие от операторных генов гены-регуляторы расположены на некотором расстоянии от структурных генов (продукты регулярных генов — репрессоры являются свободно диффундирующими белковыми молекулами).

Часто структурные гены, относящиеся к одному биохимическому пути, объединены в группу, составляющую вместе с оператором единицу транскрипции и регуляции — оперон. Все структурные гены, объединенные в оперон, имеют один операторный участок, локализованной на краю оперона, и координирование регулируются одним репрессором. Оперон представляет собой весьма рациональную и эффективную систему регуляции метаболического пути.

Рис. 32. Триптофановый оперон Е. coli и механизм репрессии конечным продуктом. А — продукт гена-регулятора (R) — неактивная форма репрессора, неспособная связываться с оператором (О); промоторный участок (Р) открыт: происходит транскрипция структурных генов (Е, D, С, В, А). Б — в присутствии корепрессора образуется активный комплекс корепрессор — репрессор, связывающийся с оператором и закрывающий промотор; транскрипции не происходит (по Lehninger, 1974)

Процесс транскрипции начинается с прикрепления РНК-полимеразы, катализирующей синтез иРНК, к определенному участку ДНК, называемому промотором (Р). Когда молекула репрессора "садится" на операторный участок, она "закрывает" промотор, тем самым препятствуя связыванию с ним РНК-полимеразы и началу транскрипции. У прокариот пять генов, кодирующих синтез ферментов триптофанового пути, образуют оперон (рис. 32). Ген-регулятор обеспечивает синтез аллостерического белка — триптофанового репрессора, не активного в свободном состоянии. Последний в таком виде не связывается с операторным участком и, следовательно, не может препятствовать началу транскрипции. Когда конечный продукт метаболического пути (триптофан) накапливается выше определенного уровня, он взаимодействует с репрессором и активирует его.

Активированный репрессор присоединяется к операторному участку и подавляет транскрипцию триптофанового оперона. Таким образом, триптофан является корепрессором.

Индукция синтеза ферментов. В большинстве случаев регуляция путем индукции характерна для катаболических путей, где в качестве индукторов выступают обычно субстраты этих путей. Классический пример индуцибельного фермента — (3-галактозидаза Е. coli . Оказалось, что если клетки Е. coli выращивать в среде, содержащей глюкозу, то они не могут использовать лактозу. Если такие клетки поместить в среду, где лактоза — единственный источник углерода, после некоторого периода в них происходит интенсивный синтез фермента (3-галактозидазы, катализирующего гидролиз лактозы на D-глюкозу и D-галактозу. С помощью этого фермента Е. coli может теперь использовать лактозу в качестве единственного источника углерода. Если затем клетки, растущие на среде с лактозой, перенести на среду с глюкозой, синтез (3-галактозидазы прекращается.

Изучение индукции (3-галактозидазы у Е. coli позволило установить, что рост клеток на среде с лактозой происходит не в результате отбора мутантов, у которых способность использовать лактозу есть следствие мутации. Способностью синтезировать этот фермент обладают все клетки. Было также показано, что в процессе индукции происходит не активирование уже имеющегося в клетках фермента (З-галактозидазы, а его синтез de novo из аминокислот.

Индуцированный синтез ферментов у микроорганизмов был описан в 30-х гг., но механизм этого процесса долгое время оставался непонятен. Индуцированный синтез ферментов лежит в основе широко известного явления адаптации организмов к различным условиям. Успехи, достигнутые в расшифровке механизмов регуляции клеточного метаболизма, позволили объяснить природу этого явления, его механизм и роль в клетке.

Лактозный оперон Е. coli , состоящий из трех структурных генов, промотора и оператора, был первой ферментной системой, на которой Ж. Моно и Ф. Жакоб изучали механизм индукции синтеза ферментов (). В отсутствие лактозы молекула репрессора, активная в свободном состоянии, связывается с оператором и подавляет транскрипцию структурных генов. Когда в клетку попадает лактоза, она связывается с репрессором, в результате образуется неактивный комплекс репрессора с индуктором, который не может взаимодействовать с оператором и, следовательно, препятствовать транскрипции структурных генов. В результате индуцируется синтез ферментов катаболизма лактозы. При удалении из клетки индуктора репрессор снова переходит в активное свободное состояние, связывается с оператором, что приводит к прекращению синтеза соответствующих ферментов.

Катаболитная репрессия. Кроме репрессии конечным продуктом, характерной для анаболических путей, описан тип репрессии, называемой катаболитной и заключающейся в том, что быстро используемые клеткой источники энергии способны подавлять синтез ферментов других путей катаболизма, участвующих в метаболизировании сравнительно медленно используемых источников энергии. Катаболитную репрессию можно рассматривать как приспособление клетки к использованию в первую очередь наиболее легко доступных источников энергии. В присутствии такого источника энергии потребление других субстратов, менее "удобных" для клетки, временно приостанавливается, и пути катаболизирования этих субстратов временно выключаются.

Выше уже отмечалось, что если в среде для выращивания Е. coli одновременно содержатся глюкоза и лактоза, сначала используется глюкоза. Несмотря на присутствие индуктора лактозного оперона, ферменты, участвующие в катаболизме лактозы, не синтезируются. Транскрипция генов лактозного оперона начинается, когда концентрация глюкозы в среде становится низкой. Таким образом, глюкоза препятствует синтезу ферментов лактозного оперона.

Как это осуществляется? Изучение механизма катаболитной репрессии обнаружило, что этот тип регуляции тесно связан с внутриклеточным уровнем циклического АМФ (цАМФ), который в этом процессе функционирует в качестве эффектора. Он образует комплекс с аллостерическим белком — катаболитным активатором, не активным в свободном состоянии. Этот комплекс, присоединившись к определенному участку на промоторе, обеспечивает возможность связывания РНК-полимеразы с промотором и инициацию транскрипции. Количество образующегося комплекса определяется концентрацией цАМФ, которая уменьшается при увеличении содержания глюкозы в среде. Таким образом, глюкоза вызывает изменение внутриклеточной концентрации цАМФ. Это соединение обнаружено в клетках всех прокариот. Его единственная функция — регуляторная. Циклический АМФ образуется из АТФ в реакции, катализируемой аденилатциклазой, связанной с ЦПМ:

АТФ ® цАМФ + пирофосфат.

Аденилатциклаза обладает высокой активностью, если компоненты системы транспорта глюкозы в клетку фосфорилированы. Это происходит в отсутствие глюкозы, которую необходимо транспортировать. Таким образом, активность аденилатциклазы возрастает при уменьшении концентрации глюкозы в среде. Последнее приводит к повышению образования цАМФ и в конечном итоге к индукции синтеза ферментов катаболизма лактозы. Наоборот, при высокой концентрации глюкозы в среде система ее транспорта находится в дефосфорилированном состоянии, следствием чего является уменьшение активности аденилатциклазы и соответственно количества цАМФ. Таким способом глюкоза через систему своего транспорта регулирует концентрацию цАМФ в клетке. Поскольку катаболизм глюкозы связан с образованием метаболической энергии и запасанием ее в молекулах АТФ, через глюкозу в клетке связаны пулы АТФ и цАМФ: при увеличении количества АТФ уменьшается количество цАМФ и наоборот.

Особенностью всех ферментных систем, находящихся под контролем катаболитной репрессии, является участие в их индукции универсального комплекса, состоящего из белкового катаболитного активатора и цАМФ.

Регуляция различных метаболических путей

Биосинтетические пути регулируются преимущественно по механизму аллостерического ингибирования первого фермента и репрессии синтеза ферментов этого пути конечным продуктом. Регулирование разветвленных биосинтетических путей осуществляется с помощью усложненных вариантов этих же механизмов.

Основные механизмы, регулирующие катаболические пути, — индукция синтеза ферментов и катаболитная репрессия. Катаболические пути, в которых функционируют конститутивные ферменты, регулируются большей частью посредством аллостерических воздействий на активность ферментов. Одна из задач катаболических путей — обеспечение клетки энергией. У большинства прокариот возможности генерации энергии намного превышает потребности в ней клетки. Количество АТФ, которое можно синтезировать с помощью имеющихся в клетках аэробных прокариот ферментов гликолитического и дыхательного путей, значительно больше количества АТФ, необходимого для процессов биосинтеза и поддержания жизнедеятельности. Поэтому клетки должны обладать способностью контролировать потребление энергодающих субстратов и, следовательно, выработку клеточной энергии. Основной принцип контроля прост: АТФ синтезируется только тогда, когда он необходим, Иными словами, интенсивность энергетических процессов у прокариот регулируется внутриклеточным содержанием АТФ.

Адениловые нуклеотиды относятся к числу важнейших эффекторов. АМФ и АДФ действуют как положительные эффекторы, стимулирующие скорость энергетических процессов и, следовательно, повышающие выход АТФ. Наоборот, АТФ служит отрицательным эффектором, сигнализирующим о превышении процессов образования АТФ над его потреблением. В результате регуляции процессов синтеза и распада АТФ в клетке поддерживается стационарное энергетическое состояние, характеризующееся так называемым энергетическим зарядом клетки:

Величина энергетического заряда теоретически может колебаться от 1 (в клетке все адениловые нуклеотиды только в виде АТФ) до 0 (в клетке содержится только АМФ). В растущей культуре величина энергетического заряда клетки равна примерно 0,8. Уменьшение его свидетельствует об ухудшении энергообеспечения организма. Когда эта величина становится ниже 0,5, клетки погибают.

Помимо адениловых нуклеотидов в регулировании энергетических процессов активную роль играют система НАД(Ф)+/НАД(Ф)-H 2 коферментов и величина трансмембранного электрохимического градиента ионов водорода в виде обоих его составляющих (Dy pH и D pH). Преобладание аллостерического взаимодействия восстановленной или окисленной форм НАД(Ф) с ферментами катаболического пути приводит соответственно к понижению или повышению их активности. Достижение определенного порогового значения Dm H + на энергопреобразующей мембране служит определенным сигналом, тормозящим поступление ионов водорода против градиента.

Регуляция процессов активного транспорта, обеспечивающего поступление подавляющего большинства необходимых прокариотам веществ, происходит на уровне синтеза переносчика и его функционирования. Биосинтез белковых компонентов многих транспортных систем регулируется по типу индукции. Глюкоза, транспортная система которой у большинства прокариот конститутивна, подавляет образование транспортных систем других сахаров и ряда органических кислот путем катаболитной репрессии. Исключение составляют некоторые облигатно аэробные прокариоты, у которых транспорт органических кислот конститутивен, а индуцируемой является транспортная система глюкозы. Избыток субстрата в среде может репрессировать синтез соответствующей транспортной системы. Это особенно характерно для аминокислот. В этом случае регуляция транспорта координирована с регуляцией их последующего метаболизма. Обнаружена также регуляция транспорта по типу отрицательной обратной связи, когда субстрат, накопленный внутри клетки, подавляет собственный транспорт из внешней среды. Таким образом, процессы клеточного транспорта находятся под контролем тех же механизмов, что и внутриклеточные анаболические и катаболические процессы.

Получение мутантов с нарушениями в системе регуляции клеточного метаболизма, приводящими к сверхсинтезу определенных метаболитов, широко используется для получения аминокислот, витаминов, полисахаридов и других веществ, имеющих практическое значение.

РЕГУЛЯЦИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

Прокариоты синтезируют вещества, регулирующие не внутриклеточный метаболизм, а межклеточные взаимодействия. Особенностями этих веществ, называемых ауторегуляторами, являются выделение их в окружающую среду, проявление биологической активности в очень низкой концентрации (10 –9 — 10 –12 M) и воздействие не на организмы иного вида, а на другие особи (клетки) того же вида. Эти вещества выделяются клетками прокариот в обычных условиях культивирования и обнаруживают строгую видо- или родоспецифичность.

Как правило, реакция, вызываемая ауторегулятором, связана с жизненным циклом прокариот. Так, стадия формирования плодовых тел в жизненном цикле миксобактерий (см. рис. 21) индуцируется ауторегулятором. веществом липидной природы, выделяемом вегетативными клетками. Клетки Myxococcus xanthus выделяют вещества, вызывающие споруляцию этого вида при их концентрации в среде порядка 10 –10 M. У Streptococcus faecalis установлен половой процесс. В клетках-реципиентах синтезируются специфические ауторегуляторы (половые регуляторы, или феромоны), под воздействием которых клетки-доноры приобретают способность прилипать к реципиенту. В результате повышается вероятность образования пары донор — реципиент.

Vibrio fischeri — обычный светящийся симбионт рыб семейства Monocentudae. Синтезируемый им ауторегулятор стимулирует образование нескольких компонентов системы свечения. Эффект обнаруживается при концентрации ауторегулятора 10 нМ, что соответствует примерно 1–2 молекулам этого соединения на бактериальную клетку. Оптимальная концентрация порядка 200 нМ (приблизительно 40 молекул ауторегулятора на клетку).

Несколько видов ауторегуляторов, контролирующих синтез антибиотика и спорообразование, обнаружено у актиномицета Streptomyces griseus. Необычное циклическое соединение, индуцирующее образование спор, идентифицировано в клеточных выделениях цианобактерии Cylindrospermum licheniforme.

Таким образом, прокариотные организмы синтезируют химические вещества-сигналы, регулирующие различные процессы, связанные с межклеточными взаимодействиями в популяции одного вида или даже штамма. Место действия ауторегуляторов — клеточные ферменты. Примечательно, что большинство изученных регуляторов — вещества липидной природы. Это позволяет им легко диффундировать через клеточные мембраны без помощи специальных транспортных систем. Феромоны S. faecalis — пептиды, содержащие 8 аминокислотных остатков, единственная гидрофильная аминокислота, входящая в состав этих пептидов, — серин. Гидрофобный характер пептидных феромонов S. faecalis также указывает на возможный неспецифический механизм их переноса через клеточные мембраны.

Выявление нового класса веществ — регуляторов жизнедеятельности прокариот на межклеточном уровне — интересно тем, что позволяет рассматривать эти организмы не просто как популяцию разрозненных клеток, но указывает на существование более высокого уровня их организации.

М.В.Гусев, Л.А.Минеева 1992-2001
Кафедра клеточной физиологии и иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова 2000-2001

Раздел 2 1. Аллостерическая модуляция

При аллостерической модуляции регуляторный фермент имеет в своей структуре один или несколько аллостерических центров, способных высоко избирательно взаимодействовать с низкомолекулярными соединениями аллостерическими модуляторами. В результате этого взаимодействия изменяется конформация белка-фермента, в том числе несколько изменяется и структура активного центра, что сопровождается изменением эффективности катализа. Если каталитическая активность фермента при этом возрастает, мы имеем дело с аллостерической активацией; если же активность фермента падает, то речь идет об аллостерическом ингибировании. Связывание аллостерического модулятора с аллостерическим центром фермента идет за счет слабых взаимодействий, поэтому оно легко обратимо: при снижении концентрации модулятора в среде окружения комплекс фермент-модулятор диссоциирует и фермент восстанавливает свою исходную конформацию, а следовательно, и каталитическую активность.

В качестве аллостерических модуляторов в клетке выступают обычно промежуточные метаболиты или конечные продукты того или иного метаболического пути. Наиболее часто встречается вариант аллостерической регуляции, известный под названием ретроингибирования или ингибирования по принципу отрицательной обратной связи. В этом случае конечный продукт метаболического пути ингибирует по аллостерическому механизму активность регуляторного фермента, катализирующего одну из начальных реакций того же метаболического пути: Так регулируются в клетках, например, метаболические пути, отвечающие за синтез пуриновых или пиримидиновых нуклеотидов.

В качестве второго варианта аллостерической регуляции можно привести механизм активации предшественников. В этом случае один из промежуточных метаболитов, образующихся в начале метаболического пути, выступает в качестве аллостерического активатора того или иного фермента, катализирующего одну из конечных реакции того же самого метаболического пути:…. Примером может служить активация пируваткиназы фруктозо-1,6-бисфосфатом в метаболическом пути окислительного распада глюкозы.

Разумеется, совершенно не обязательно, чтобы в качестве аллостерического модулятора регуляторного фермента выступал промежуточный или конечный метаболит того же самого метаболического пути. Существует множество примеров сопряженной аллостерической модуляции, когда в качестве аллостерического модулятора выступает соединение, образующееся в другом метаболическом пути. Так, накопление в клетке АТФ, основное количество которой образуется в ходе окислительного фосфорилирования в цепи дыхательных ферментов, угнетает по аллостерическому механизму активность фосфоруктокиназы фермента гликолиза, угнетает активность глутаматдегидрогеназы фермента из системы трансдезаминирования, угнетает активность изоцитратдегидрогеназы фермента цикла Кребса. Следует лишь отметить, что между такими метаболическими путями можно проследить тот или иной уровень функциональной взаимосвязи. В приведенном ранее примере все три метаболических процесса связаны между собой тем, что их функционирование имеет прямое отношение к наработке в клетке АТФ, т.е. к обеспечению клетки доступной энергией.

2. Ковалентная модификация

Ковалентная модификация это механизм регуляции активности ферментов за счет присоединения с помощью ковалентной связи в регуляторном центре фермента атомной группировки или отщепления этой группировки. Присоединение к ферменту ковалентной связью дополнительной группировки приводит к изменению конформации белка-фермента, что сопровождается изменением структуры активного центра и изменением эффективности катализа. Отщепление этой группировки обеспечивает восстановление исходной конформации фермента, а следовательно, и возвращение к исходному уровню его каталитической активности. В качестве таких модифицирующих группировок могут выступать остатки адениловой кислоты, гликозильные остатки, но чаще всего встречается фосфорилирование присоединение остатков фосфорной кислоты. Поскольку в ходе ковалентной модификации происходит образование или расщепление ковалентной связи между ферментом и группировкой модулятором, для эффективной работы этого механизма требуется два дополнительных фермента: один фермент обеспечивает присоединение группировки-модулятора к регуляторному ферменту, второй фермент обеспечивает удаление этой группировки. По-видимому, эти дополнительные ферменты обеспечивают присоединение группировки-модулятора к строго определенному аминокислотному остатку полипептидной цепи регуляторного фермента, так же как и избирательное ее отщепление. Примерами работы таких регуляторных механизмов могут служить: активация гликогенфосфорилазы путем ее фосфорилирования, активация глутаматдегидрогеназы путем ее аденилирования, снижение активности пируватдегидрогеназного комплекса в результате его фосфорилирования, снижение активности гликогенсинтетазы путем ее фосфорилирования. Полный цикл регуляции активности фермента путем его ковалентной модификации может быть проиллюстрирован на примере гликогенфосфорилазы гепатоцитов

3. Белок-белковое взаимодействие

По современным представлениям ферменты отдельных метаболических путей объединены в клетках в большинстве своем в мультиэнзимные комплексы метаболоны. В составе таких метаболонов каждый фермент находится в контакте с одним или несколькими ферментами этого метаболического пути. Поэтому конформация, а следовательно и каталитическая активность каждого отдельного фермента будет зависеть от состояния других контактирующих с ним ферментов. Отсюда, изменение каталитической активности регуляторного фермента, входящего в состав метаболона, вызванное, например, присоединением к нему аллостерического модулятора, будет сопровождаться изменением активности и других ферментов метаболона, поскольку их конформация в составе надмолекулярного белкового комплекса будет также претерпевать определенные изменения. В клетках и во внеклеточной жидкости присутствуют белки, которые могут взаимодействовать с белками-ферментами, регулируя их активность. Эти белки получили название белков-модуляторов.

Так, в состав липопротеидов плазмы крови входят апобелки апо-С-II и апо-С-I, которые взаимодействуя с ферментами липопротеидлипазой и лецитинхолестеролацилтрансферазой соответственно, увеличивают их активность. В плазме крови присутствует также белок-модулятор антитромбин-III, который взаимодействуя с ферментом системы свертывания крови тромбином, инактивирует последний.

Примером внутриклеточного белка-модулятора может служить кальмодулин. Он присутствует в свободном неактивном состоянии в цитозоле клеток различных органов и тканей. При увеличении концентрации в цитозоле ионов Са2+ образуется Са-кальмодулиновый комплекс, конформация кальмодулина изменяется и Са-кальмодулиновый комплекс приобретает способность взаимодействовать с различными внутриклеточными ферментами. При этом взаимодействии конформация белка-фермента изменяется и, следовательно, изменяется его каталитическая активность. При снижении концентрации Са2+ в цитозоле Са-кальмодулиновый комплекс распадается, свободный кальмодулин из-за изменения конформации молекулы теряет сродство к ферменту. В результате фермент высвобождается из комплекса и его каталитическая активность возвращается к исходному уровню. Этим способом регулируется каталитическая активность таких ферментов как гуанилатциклаза, фосфодиэстераза циклических нуклеотидов, пируваткарбоксилаза, НАД-киназа и др. (см.схему на след. стра-це).

4. Роль конкурентного и неконкурентного ингибирования в регуляции активности ферментов в клетке

Эти варианты механизмов регуляции активности ферментов в клетках используются крайне редко. Примером конкурентного ингибирования, используемого в клетке для регуляции собственного метаболизма, принято считать угнетение активности сукцинатдегидрогеназы фермента цикла трикарбоновых кислот высокими концентрации щавелевоуксусной кислоты или малата, являющимися промежуточными продуктами того же самого метаболического пути. Снижение их концентрации в матриксе митохондрий, где работает этот метаболический путь, снимает ингибирование, т.е. регуляторный эффект обратим.

Необходимо иметь в виду, что лекарственные препараты часто являются конкурентными или неконкурентными ингибиторами различных ферментов. Так, лекарственный препарат алллопуринол, используемый при лечении подагры, является типичным конкурентным ингибитором фермента ксантиноксидазы, работающей в клетке на завершающем этапе метаболического пути синтеза мочевой кислоты. Снижение активности этого фермента приводит к падению концентрации мочевой кислоты в крови и тканях и предотвращает характерное для подагры повторное выпадение кристаллов мочевой кислоты в тканях.

Лекарственный препарат строфантин G, используемый при лечении острой сердечной недостаточности, является неконкурентным ингибитором К,Na-АТФ-азы наружных клеточных мембран миокардиоцитов. Существует мнение, что лечебный эффект этого лекарственного препарата обусловлен нормализацией ионного состава внутренней среды миокардиоцитов в результате коррекции активности этого мембранного фермента.

Среди множества ферментов, имеющихся в клетке, далеко не все являются регуляторными. Тем не менее, практически в каждый метаболический путь включены один или несколько (2, иногда даже 3) ферментов, контролирующих интенсивность потока метаболитов по тому или иному метаболическому пути. Эти ферменты обычно катализируют необратимые по термодинамическим причинам реакции; они часто являются ферментами, имеющими наиболее низкую каталитическую активность среди всех ферментов данного метаболического пути, и поэтому контролируют интенсивность потока вещества по данному метаболическому пути в целом; они обычно катализируют одну из первых реакций данного метаболического пути, что предотвращает накопление промежуточных продуктов метаболического пути в клетке при снижении активности фермента. Такого рода ферменты, контролирующие поток метаболитов по метаболическому пути и способные отвечать изменениями активности на регуляторные воздействия, получили название "ключевых ферментов"; иногда их также называют "ферментами водителями ритма". Примерами таких ферментов могут служить аспартаткарбамоилтрансфераза (метаболический путь синтеза пиримидиновых нуклеотидов), фосфофруктокиназа (гликолиз) или изоцитратдегидрогеназа (цикл трикарбоных кислот Кребса).

5. Перенос веществ через клеточные мембраны

Клетка для регуляции своего метаболизма может использовать изменение проницаемости мембран, в том числе как проницаемость как наружной мембраны, так и мембран, разделяющих ее отдельные компартменты. Тем самым может регулироваться как концентрация субстратов для того или иного метаболического пути (например, концентрация ацетил-КоА в цитозоле для синтеза высших жирных кислот, поступающего из матрикса митохондрий), так и концентрация кофакторов, поступающих из одного компартмента клетки в другой (например, АДФ, поступающего из цитозоля в матрикс митохондрий).

Перенос веществ через клеточные мембраны может осуществляться за счет процессов трех основных типов:

а) простой диффузии,

б) облегченной диффузии,

в) активного транспорта.

Интенсивность простой диффузии, т.е. переноса веществ через мембрану по градиенту концентрации через липидный бислой или через каналы в липидном бислое, регулируется, во-первых, за счет изменения конформационного состояния мембраны или ее микровязкости, во-вторых, за счет изменения концентрации переносимого метаболита по разные стороны мембраны. Состояние мембраны может изменяться за счет изменения ее состава, например, за счет изменения содержания холестерола в мембранах, а изменение градиента концентрации метаболита относительно мембраны может изменяться путем его наработки или использования в одном из компартментов клетки.

Регуляция облеченной диффузии, т.е. переноса веществ через мембрану по градиенту концентрацию с участием переносчика, осуществляется как за счет действия ранее указанных факторов, так и за счет двух новых механизмов: изменения содержания переносчика в мембране или же за счет изменения функционального состояния состояния имеющихся переносчиков. Так, при воздействии инсулина на клетки, имеющие рецепторы к этому гормону, в их наружных мембранах увеличивается количество белков-переносчиков глюкозы. Изменение интенсивности активного транспорта, т.е. переноса веществ через мембраны с участием переносчика против градиента концентрации, идущего с затратами энергии, происходит, во-первых, за счет работы механизмов, регулирующих процессы облегченной диффузии, а, во-вторых, за счет изменения количества доступной энергии. В свою очередь, поступление энергии осуществляется или за счет обеспечения механизмов транспорта энергией АТФ, или же за счет создаваемых клеткой трансмембранных электрохимических градиентов, например, градиентов Н+ или градиентов ионов Na+.

Таким образом, в ходе эволюции природой были созданы разнообразные механизмы, позволяющие клеткам регулировать как интенсивность обменных процессов в целом, так и механизмы избирательной регуляции работы того или иного метаболического пути. Все регуляторные механизмы, работающие в организме можно разделить на два уровня: 1. Механизмы, обеспечивающие регуляцию на уровне отдельных клеток или внутриклеточные регуляторные механизмы.

2. Механизмы, обеспечивающие регуляцию обменных процессов на уровне целого организма надклеточные регуляторные механизмы.

Каждый из этих уровней может быть разделен на подуровни. Так, в рамках внутриклеточного уровня регуляции могут быть выделены подуровни:

подуровень отдельных химических реакций,

подуровень метаболических путей,

подуровень клеточных органелл,

подуровень сети метаболических путей. А надклеточный уровень регуляции может быть разделен на подуровни:

подуровень той или иной ткани

подуровень того или иного органа

подуровень системы органов

подуровень целого организма.

Раздел 3 1.

В основу второго варианта классификации заложена химическая природа гормонов. По химической природе гормоны делятся на 4 класса:

1. Гормоны белковой природы, причем в этом классе можно выделить два подкласса:

а) гормоны простые белки (инсулин, соматотропин);

б) гормоны сложные белки (тиреотропный гормон, гонадотропные гормоны), по химической природе они представляют собой гликопротеиды)

2. Гормоны полипептиды (либерины и статины гипоталамуса, вазопрессин и окситоцин, глюкагон, кортикотропин).

3. Гормоны производные аминокислот (мелатонин, адреналин, иодированые тиронины).

4. Гормоны стероидной природы (кортизол, альдостерон, прогестерон, эстрадиол, тестостерон).

2. Клетки-мишени и рецепторы гормонов

Клетки, способные тем или иным образом отвечать на воздействие какого-либо гормона, получили название клеток-мишеней для данного гормона. В свою очередь, органы или ткани, в которых воздействие гормона вызывает специфическую биохимическую или физиологическую реакцию, получили название органымишени или ткани-мишени для данного гормона. Следует лишь иметь в виду, что та или иная ткань обычно содержит несколько типов дифференцированных клеток и далеко не все они реагируют на воздействие конкретного гормона.

Для того, чтобы клетка реагировала на появление в окружающий ее среде гормона или другой сигнальной молекулы, она должна иметь в своем составе специализированные структуры, способные распознавать эти сигнальные молекулы. Такими специализированными структурами являются клеточные рецепторы. По химической природе клеточные рецепторы представляют собой сложные белки гликопротеиды, имеющие в своей структуре специализированные функциональные центры, способные к избирательному взаимодействию с той или иной сигнальной молекулой.

Все рецепторы являются полидоменными белками. На одном из доменов располагается центр связывания сигнальной молекулы это так называемый домен узнавания. Кроме домена узнавания в составе рецепторов всегда имеется домен, отвечающий за запуск внутриклеточных механизмов, обеспечивающих ответ клетки на внешний регуляторный сигнал это так называемый домен сопряжения. Взаимодействие центра связывания рецептора с своей сигнальной молекулой, например с гормоном, изменяет конформацию домена узнавания, волна конформационных изменений захватывает и домен сопряжения, что приводит к "активации" рецептора и включению внутриклеточных механизмов реализации внешнего регуляторного сигнала.

3. Рилизинг-гормоны (либерины)

1. Тиролиберин (ТРГ) стимулирует выделение тиреотропного гормона (ТТГ) гипофиза.

2. Кортиколиберин (КРГ) стимулирует выделение адренокортикотропного гормона (АКТГ) гипофиза.

3. Гонадолиберин (ГнРГ) стимулирует выделение лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулстимулирующего (ФСГ) гормонов гипофиза.

4. Соматолиберин (СТГ-РГ) стимулирует выделение соматотропного гормона (СТГ) гипофиза.

Предполагается также существование в гипоталамусе пролактолиберина (ПРЛ-РГ) и либерина меланоцитстимулирующего гормона (МСГ-РГ), однако до настоящего времени получить их в высокоочищенном виде не удалось. б). Статины 1. Соматостатин (СС), ингибирующий выделение СТГ из гипофиза; кроме того, он ингибирует выделение ТТГ.

2. Гонадолиберин-ассоциированный пептид (ГАП), ингибирующий выделение пролактина (ПРЛ) из гипофиза; кроме того, выделение ПРЛ сильно ингибируется дофамином. Иногда ГАП и дофамин объединяют под названием пролактин-ингибирующие гормоны (ПИГ). Предполагается также существование меланостатина (МСГ-С), однако его существование не было подтверждено.

Третью группу гормонов гипоталамуса составляю два гормона окситоцин и вазопрессин, которые, синтезируясь в гипоталамусе, поступают в заднюю долю гипофиза, где временно накапливаются, а затем поступают в кровяное русло. Гормоны гипофиза также можно разделить на три группы. Первую группу составляют гормоны передней доли гипофиза, стимулирующие деятельность периферических желез внутренней секреции. К ним относятся:

1. ТТГ, стимулирующий синтез тетраиодтиронина (Т4) и трииодтиронина (Т3) в щитовидной железе.

2. АКТГ, стимулирующий синтез глюкокортикоидов корой надпочечников.

3. ЛГ и ФСГ, стимулирующих синтез половых гормонов в семенниках и яичниках.

4. В работе регуляторных механизмов, использующих в качестве вторых вестников цАМФ, цГМФ или продукты гидролиза инозитолфосфатидов, имеется один общий момент в системы включены механизмы усиления сигнала. Гормон или иная сигнальная молекула, соединяясь с рецептором, активирует фермент, генерирующий образование в клетке множества молекул, выполняющих роль второго вестника. В свою очередь второй вестник также активирует фермент, способный быстро изменять функциональную активность большого числа различных белковых молекул, непосредственно отвечающих за формирование метаболического ответа клеток. Механизм действия гормонов в значительной мере зависит от физико-химических свойств молекул гормонов. Гормоны белковой природы, гормоны-пептиды, гормоны-производные аминокислот за исключением иодированных тиронинов, как и родственные по химической природе другие сигнальные молекулы, обладая гидрофильными свойствами, не способны проникать через наружные мембраны клеток. Рецепторы этих биорегуляторов локализованы на внешней стороне наружной клеточной мембраны, поэтому требуется специальный механизм, обеспечивающий трансформацию внеклеточного регуляторного сигнала в сигнал внутриклеточный. Как правило, это связано с синтезом в клетке соединений, выступающих в качестве внутриклеточных мессенджеров или "вторых вестников", обеспечивающих формирование метаболического ответа клеток на внешний регуляторный сигнал.

5. Гормоны стероидной природы и иодированные тиронины, имеющие гидрофобные свойства, могут проникать через наружную мембрану внутрь клеток и, связываясь со своими рецепторами в цитозоле или ядре, сами участвуют в формировании метаболического ответа клеток на внешний регуляторный сигнал, в связи с чем эти биорегуляторы не нуждаются в посредниках типа "вторых вестников".Регуляторный эффект гормонов первой группы базируется в первую очередь на изменении функциональной активности уже имеющихся в клетке белков, тогда как в основе регуляторных эффектов гормонов-стероидов и иодированных тиронинов в первую очередь лежит изменение эффективности экспрессии генов и на этой основе изменение количества белков в клетке. Безусловно, при воздействии гормонов-белков, гормонов-пептидов и гормонов-производных аминокислот также может происходить изменение эффективности экспрессии генов, но это результат воздействия на геном клеток модифицированных белков-регуляторов, структура которых обычно изменяется при опосредованном участии внутриклеточных мессенджеров. Эти соединения известны под название внутриклеточных мессенджеров или вторых вестников, наиболее известными представителями которых являются цАМФ, цГМФ, ионы Са+, продукты расщепления инозитолфосфатидов инозитолтрифосфат и диацилглицерол.

Раздел 4. 1. ИНСУЛИН

Инсулин относится к гормонам белковой природы. Он синтезируется b-клетками поджелудочной железы. Инсулин является одним из важнейших анаболических гормонов. Связывание инсулина с клеткамимишенями приводит к процессам, которые увеличивают скорость синтеза белка, а также накопление в клетках гликогена и липидов, являющихся резервом пластического и энергетического материала. Инсулин, возможно за счет своего анаболического эффекта, стимулирует рост и размножение клеток.

Молекула инсулина состоит из двух полипептидных цепей А-цепи и В-цепи. В состав А-цепи входит 21 аминокислотный остаток, в состав В-цепи 30. Эти цепи связаны между собой двумя дисульфидными мостиками: один между А7 и В7 (номера аминокислот, считая с N-концов полипептидных цепей), второй между А20 и В19. Третий дисульфидный мостик находится в цепи А, связывая А6 и А11.

Главным физиологическим стимулом выделения инсулина из b-клеток в кровь является повышение содержания глюкозы в крови.

Влияние инсулина на обмен углеводов можно охарактеризовать следующими эффектами:

1.Инсулин увеличивает проницаемость клеточных мембран для глюкозы в так называемых инсулин-зависимых тканях.

2.Инсулин активирует окислительный распад глюкозы в клетках.

3.Инсулин ингибирует распад гликогена и активирует его синтез в гепатоцитах.

4.Инсулин стимулирует превращение глюкозы в резервные триглицериды.

5.Инсулин ингибирует глюконеогенез, снижая активность некоторых ферментов глюконеогенеза.

Влияние инсулина на обмен липидов складывается из ингибирования липолиза в липоцитах за счет дефосфорилирования триацилглицероллипазы и стимуляции липогенеза.

Инсулин оказывает анаболическое действие на обмен белков: он стимулирует поступление аминокислот в клетки, стимулирует транскрипцию многих генов и стимулирует, соответственно, синтез многих белков, как внутриклеточных, так и внеклеточных.

2.ТИРОНИНЫ

Щитовидная железа вырабатывает два гормона 3,5,3-трииодтиронин (Т3) и 3,5,3,5-тетраиодтиронин (тироксин, Т4), играющие важную роль в регуляции общего метаболизма, развития и дифференцировки тканей. Образование этих гормонов происходит в ходе посттранскрипционного процессинга специфического белка тиреоглобулина, в ходе которого происходит органификация накапливающегося в клетках щитовидной железы иода. Последующий внутриклеточный протеолиз иодированного тиреоглобулина приводит к высвобождению гормонов.

Синтез иодированных тиронинов идет в клетках щитовидной железы тироцитах в составе белка иодтиреоглобулина.

Синтез тиреоглобулина происходит на рибосомах тироцита в базальной части клетки, далее в цистернах шероховатого эндоплазматического ретикулума, а затем в аппарате Гольджи происходит гликозилирование полипептидных цепей молекулы с присоединением порядка двух десятков олигосахаридных блоков.

Инактивация тиреоидных гормонов осуществляется различными путями: они могут подвергаться деиодированию, дезаминированию, декарбоксилированию. Во всех этих случаях гормоны теряют свою биологическую активность. В печени продукты деградации тиреоидных гормонов могут подвергаться коньюгации с последующим их выделением с желчью.

Рецепторы для тиреоидных гормонов имеются в клетках различных органов и тканей. Низкоаффинные рецепторы расположены в цитозоле клеток, тогда как высокоаффинные в ядрах тех же клеток. Введение тироксина экспериментальным животным сопровождается развитием положительного азотистого баланса, увеличивает теплопродукцию и приводит к увеличению активности многих ферментных систем. К настоящему времени показано, что введение гормона приводит к повышению активности более 100 ферментов. Это увеличение активности большого числа ферментов скорее всего отражает резко выраженное стимулирующее действие гормона на синтез белка во многих органах и тканях.

Введение тиреоидных гормонов действительно приводит к увеличению теплопродукции, но это увеличение теплобразования обусловлено не разобщением окисления и фосфорилирования в митохондриях, а увеличением расходования АТФ в клетках в энергозависимых процессах.

3.АДРЕНАЛИН

Хромафинные клетки мозгового вещества надпочечников продуцируют группу биологически активных веществ катехоламинов, к числу которых относятся адреналин, норадреналин и дофамин, играющие важную роль в адаптации организма к острым и хроническим стрессам, в особенности в формировании реакции организма типа "борьба или бегство". В ходе развития этой реакции в организме происходит экстренная мобилизация энергетических ресурсов: ускоряется липолиз в жировой ткани, активируется гликогенез в печени, стимулируется гликогенолиз в мышцах.

Все катехоламины синтезируются из аминокислоты тирозина, причем на долю адреналина приходится примерно 80% катехоламинов, образующихся в мозговом веществе надпочечников. Синтез начинается с превращения тирозина в дигидроксифенилаланин (ДОФА), реакция катализируется ферментом тирозин-гидроксилазой. Простетической группой фермента является тетрагидробиоптерин. В ходе следующей реакции ДОФА подвергается декарбоксилированию при участии фермента ДОФА-декарбоксилазы, простетической группой этого фермента служит пиридоксальфосфат.

Образуется ДОФамин. В ходе окисления в качестве донора электронов (косубстрат реакции) используется аскорбиновая кислота. В заключительной реакции идет метилирование норадреналина по аминогруппе с превращением его в адреналин, в качестве донора метильной группы используется S-аденозилметионин.

Под воздействием нервных импульсов, поступающих в мозговое вещество надпочечников по чревному нерву, происходит слияние хромаффинных гранул с плазматической мембраной с выбросом катехоламинов в русло крови. Поступающий в кровяное русло адреналин в виде слабоассоциированного с альбуминами комплекса разносится с током крови в другие органы и ткани.

Продолжительность существования адреналина в русле крови измеряется временем порядка 10 30 секунд; его концентрация в плазме крови в норме не превышает 0,1 мкг/л (менее 0,55 нМ/л). Инактивация адреналина, как и других катехоламинов, может идти или путем их окислительного дезаминирования, или путем О-метилирования. Основными конечными продуктами инактивации адреналина, выделяющимися с мочой, являются метанефрин и ванилинминдальная кислота.

При связывании гормона с b1и b2-рецепторами идет активация аденилатциклазы, опосредованная взаимодействие активированных рецепторов с Gs-белками, что сопровождается увеличением концентрации цАМФ в клетке. При взаимодействии гормона с a2-рецептором при участии Gi-белка идет ингибирование аденилатциклазы и снижение концентрации цАМФ в клетке.

В случае действия адреналина через b2-рецепторы идет стимуляция расщепления гликогена в печени с выходом глюкозы в кровяное русло, одновременно идет небольшая стимуляция глюконеогенеза в гепатоцитах. В мышцах через b2-рецепторы адреналин стимулирует гликогенолиз. Через этот тип рецепторов адреналин повышает секрецию инсулина и глюкагона в поджелудочной железе или секрецию ренина в почках.

4. ГЛЮКАГОН

Глюкагон представляет собой гормон полипептидной природы, выделяемый a-клетками поджелудочной железы. Основной функцией этого гормона является поддержание энергетического гомеостаза организма за счет мобилизации эндогенных энергетических рессурсов, этим объясняется его суммарный катаболический эффект.

В состав полипептидной цепи глюкагона входит 29 аминокислотных остатков, его молекулярная масса 4200, в его составе отсутствует цистеин. Глюкагон был синтезирован химическим путем, чем была окончательно подтверждена его химическая структура.

Основным местом синтеза глюкагона являются a-клетки поджелудочной железы, однако довольно большие количества этого гормона образуются и в других органах желудочно-кишечного тракта. Синтезируется глюкагон на рибосомах a-клеток в виде более длинного предшественника с молекулярной массой около 9000. В ходе процессинга происходит существенное укорочение полипептидной цепи,после чего глюкагон секретируется в кровь. В крови он находится в свободной форме, его концентрация в сыворотке крови составляет 20-100 нг/л. Период его полужизни равняется примерно 5 минутам. Основная часть глюкагона инактивируется в печени путем гидролитического отщепления 2 аминокислотных остатков с N-конца молекулы.

Секреция глюкагона a-клетками поджелудочной железы тормозится высоким уровнем глюкозы в крови, а также соматостатином, выделяемым D-клетками поджелудочной железы. Возможно, что секреция глюкагона ингибируется также инсулином или ИФР-1. Стимулируется секреция понижением концентрации глюкозы в крови, однако механизм этого эффекта неясен. Кроме того, секрецию глюкагона стимулируют соматотропный гормон гипофиза, аргинин и Са2+.

Механизм действия глюкагона достаточно хорошо изучен. Рецепторы для гормона локализованы в наружной клеточной мембране. Образование гормонрецепторных комплексов сопровождается активацией аденилатциклазы и увеличением в клетках концентрации цАМФ, сопровождающимся активацией протеинкиназы и фосфорилированием белков с изменением функциональной активности последних.

Под действием глюкагона в гепатоцитах ускоряется мобилизация гликогена с выходом глюкозы в кровь. Этот эффект гормона обусловлен активацией гликогенфосфорилазы и ингибированием гликогенсинтетазы в результате их фосфорилирования. Следует заметить, что глюкагон, в отличие от адреналина, не оказывает влияния на скорость гликогенолиза в мышцах.

Глюкагон активирует процесс глюконеогенеза в гепатоцитах: во-первых, он ускоряет расщепление белков в печени, а образующиеся аминокислоты используются как субстраты глюконеогенеза; во-вторых, увеличивается активность ряда ферментов, таких как фруктозо-1,6-бисфосфатаза, фосфоенолпируваткарбоксикиназа, глюкозо-6-фосфатаза, принимающих участие в глюконеогенезе как за счет активации имеющихся ферментов, так и индукции их синтеза. За счет активации глюконеогенеза также происходит увеличение поступления глюкозы в кровь. Ускорение использования аминокислот для глюконеогенеза сопровождается увеличением объема синтеза мочевины и увеличением количества мочевины, выводимого с мочой.

Глюкагон стимулирует липолиз в липоцитах, увеличивая тем самым поступление в кровь глицерола и высших жирных кислот. В печени гормон тормозит синтез жирных кислот и холестерола из ацетил-КоА, а накапливающийся ацетил-КоА используется для синтеза ацетоновых тел. Таким образом, глюкагон стимулирует кетогенез.

В почках глюкагон увеличивает клубочковую фильтрацию, по-видимому, этим объясняется наблюдаемое после введения глюкагона повышение экскреции ионов натрия, хлора, калия, фосфора и мочевой кислоты.

5. КОРТИЗОЛ

Основным глюкокортикоидом человека являет-ся кортизол: за сутки в надпочечниках синтезируется 10-30 мг кортизола и 2-4 мг другого глюкокортикоида кортикостерона. Гормоны коры надпочечников, в особенности глюкокортикоиды, играют важную роль в адаптации к сильным стрессам.

В основе структуры всех стероидных гормонов лежит лежит циклопентанпергидрофенантреновое ядро, имеющее в своем составе 17 атомов углерода и включающее в себя четыре цикла или кольца, обозначаемых буквами А,В,С и D.

Синтез кортизола идет в клетках пучковой и сетчатой зон коры надпочечников. Исходным соединением для синтеза кортизола является холестерол, он поступает в клетки коры надпочечников из крови, лишь незначительная его часть образуется в клетках путем синтеза из ацетил-КоА.

На секрецию кортизола большое влияние оказывают физические и эмоциональный стрессы, состояние тревоги, страха и др., но все эти эффекты опосредуются нервной системой через гипоталамическое звено регуляции.

Введение кортизола приводит к увеличению содержания высших жирных кислот в плазме крови. Частично это может быть результатом стимуляции липолиза в клетках жировой ткани. Интересно, что избыточные количества кортизола стимулируют липолиз в жировой ткани конечностей, однако одновременно стимулируется липогенез в жировой ткани туловища и лица. В повышение уровня высших жирных кислот вносит определенный вклад торможение поступления глюкозы в клетки периферических тканей: во-первых, недостаток глюкозы в клетках периферических тканей приводит к усилению мобилизации резервных триглицеридов, во-вторых, недостаток глюкозы в липоцитах приводит к недостатку в них фосфодигидроксиацетона, необходимого для синтеза триглицеридов неиспользованные высшие жирные кислоты также поступают из липоцитов в кровь.

Целью любого биотехнологического производства является получение максимально возможного количества целевого продукта с единицы объема установки при минимально возможных затратах. На практике существует два основных пути решения этих задач, которые заключаются с одной стороны в создании новых штаммов микроорганизмов, обладающих повышенной продукционной способностью, т.е. способностью к синтезу того или иного целевого продукта, а с другой стороны в создании оптимальных условий для протекания в клетках интересующего нас метаболитического процесса.

Решение этих задач в той или иной степени связано с изменением регуляторных процессов в клетке, поэтому в настоящем разделе мы рассмотрим некоторые механизмы регуляции биохимической активности бактериальной клетки.

В нормально функционирующей живой клетке одномоментно протекает множество катализируемых ферментами химических реакций, приводящих к образованию огромного количества разнообразных соединений. В норме обмен веществ в клетке (метаболизм ) осуществляется по принципам строжайшей экономии энергии и вещества, что обеспечивается сложнейшей системой регуляции обмена веществ.

Все процессы клеточного метаболизма можно условно разделить на две группы.

1. Процессы, в которых происходит разложение сложных веществ до более

простых с получением энергии называются катаболитическими катаболитами .

2. Процессы, в которых происходит синтез сложных веществ из простых с потреблением энергии называются анаболитическими , а промежуточные и конечные продукты – анаболитами .

Между катаболитическими и анаболитическими процессами в клетке существует тесная взаимосвязь. Катаболитические процессы служат источником энергии и “строительного материала” для анаболитических процессов, а продукты анаболизма могут служить субстратом для катаболитичких процессов (питательные вещества) или выполнять функции катализаторов (белки-ферменты).

Самый простой способ регуляции любого метаболического пути основывается на доступности субстрата. Действительно, в соответствии с законом действия масс, снижение количества субстрата-реагента (его концентрации в среде) приводит к снижению скорости протекания процесса (реакции) через данный метаболический путь. С другой стороны, повышение концентрации субстрата приводит к стимулированию этого метаболического пути. Поэтому, независимо от каких-то иных факторов, наличие (доступность) субстрата является важнейшим механизмом интенсификации любого метаболического процесса. Иногда эффективным средством повышения выхода целевого продукта является увеличение концентрации в клетке какого-либо определенного предшественника. Однако, в отличие от химических процессов, в биотехнологии данный путь имеет свои ограничения, т.к. высокие концентрации субстратов (больше 3-5%), например глюкозы или сахарозы, обычно резко тормозят рост микроорганизмов, что используется, например, для консервирования ягод и фруктов. Связано это, прежде всего с осмотическим эффектом, который вызывается большой разностью в концентрации этих веществ внутри клеток и в окружающей среде.

Однако в клетках имеется на много порядков более эффективный механизм контроля метаболитических процессов, основанный на регуляции ферментативного аппарата клетки. Такая регуляция может осуществляться по крайней мере двумя путями. Один из них очень быстрый (реализующийся в течение секунд или минут) заключается в изменении каталитической активности уже имеющихся молекул фермента. Второй, более медленный (реализуется в течение многих минут), состоит в изменении скоростей синтеза (количества) ферментов. В обоих механизмах используется единый принцип управления системами – принцип обратной связи.

Поскольку все процессы протекающие в клетке требуют участия специфических белковых катализаторов – ферментов, то общее количество ферментов в клетках может варьироваться от нескольких десятков до нескольких сотен, а процентная доля их по отношению к другим клеточным белкам будет достаточно большой (до нескольких процентов даже для одного фермента).

Однако энергетических (АТФ) и сырьевых ресурсов клетки (аминокислот) не хватает для одновременного синтеза всех необходимых ферментов. Поэтому постоянно синтезируются только те ферменты, которые поддерживают основные клеточные функции (например ферменты гликолиза, ЦТК). Такие ферменты называют конститутивными. Другие ферменты, адаптивные или индуцибельные, синтезируются только в ответ на появление каких то внешних факторов или веществ – индукторов, которые являются субстратами (питательными веществами) или их аналогами.

Уровень синтеза таких ферментов регулируется двумя механизмами – индукцией и репрессией .

Под индукцией понимают относительное увеличение синтеза одного фермента или группы ферментов, участвующее в одной и той же последова-тельности реакций, например в разложении какого-то сложного вещества до более простых. Ферменты, синтез которых регулируется таким образом, называют адаптивными или индуцированными (индуцибельными ), а субстраты, вызывающие их синтез - индукторами . Под влиянием индукторов количество адаптив­ных ферментов может возрастать в сотни раз. Так, для E.coliуста­новлено, что у культуры, выросшей на среде с глюкозой, обнаруживает лишь следы β-галактозидазы, осуществляющей реакцию расщепления лактозы до α-галактозы и D-глюкозы. При перенесении культуры на среду с лактозой, уже через несколько минут, начинается активный синтез β-галактозидазы и у адаптированной культуры до 3% от содержания белка приходится на этот фермент.

Для индуцируемых ферментов установлено, что:

а) фермент появляется во всех клетках одновременно и это нельзя объяснить мутациями;

б) индуцированный фермент целиком синтезируется в клетке из аминокислот или, как говорят, образуется de novo (изначально).

в) фермент синтезируется до тех пор, пока в среде есть индуктор. Через индукцию регулируется синтез ферментов, участвующих в катаболических процессах, т.е. индуцируемые ферменты необходимы для пог­лощения клеткой субстратов и включения их в обмен.

При промышленном получении ферментов, часто великолепными индукторами являются неутилизируемые структурные аналоги субстратов. Например, для β-галактозидазы таким веществом служит изопропил-β – D-тио-галактопиранозид (ИПТГ) неметаболизируемый аналог лактозы. Это позволяет увеличить выход фермента, который при этом не расходуется в ферментативной реакции и облегчить его очистку т.к. ИПТГ берется в количестве значительно меньшем, чем лактоза и в культуральной жидкости нет продуктов ее распада.

Вторым механизмом регуляции синтеза ферментов является репрес­сия , когда наблюдается относительное уменьшение синтеза фермента или группы ферментов, участвующих в одной и той же последователь­ности реакций, В зависимости от природы репрессоров различают реп­рессию конечным продуктом и репрессию катаболитами . Репрессия конечным продуктом наблюдается только для ферментов, осуществлявших анаболические реакции. При наличии в клетке конечного продукта ана­болического пути снижается скорость синтеза всех ферментов, участ­вующих в его образовании. Этот процесс позволяет экономить клеточ­ный белок, останавливая синтез тех ферментов, которые в данный мо­мент не требуются клетке.

Репрессия катаболитами характерна для реакций разложения сложных органических веществ микроорганизмами. Этот механизм позволяет клетке использовать более доступный субстрат, обеспечивавший высо­кую скорость роста культуры. Предпочтение отдается тем субстратам, разложение которых включает меньшее число стадий: микроорганизмы предпочитают простые сахара сложным, аминокислоты - пептидам и т.д. Одним из примеров катаболитной репрессии является “глюкозный эф­фект" - явление, наблюдаемое при выращи-вании микроорганизмов на средах, содержащих наряду с глюкозой другие источники углерода. Глюкоза, как наиболее легко усвояемый субстрат, метаболизируется в клетке и продукты ее разложения тормозят синтез ферментов, участвующих в усвоении более сложных субстратов до тех пор, пока не будет использована вся глюкоза.

Регуляция обмена веществ микробной клетки может происходить также путем изменения ферментативной активности имеющихся ферментов. Это явление наблюдается преимущественно в анаболитических процессах. Наиболее изученным механизмом является ингибирование активности ферментов конечным продуктом (ретроингибирование), когда активность фермента, стоящего в начале многоступенчатого превращения субстрата тормозится конечным метаболитом.

Впервые о наличии такого регуляторного механизма было сообщено в 1953 г. При изучении биосинтеза триптофана клетками E.coli. Заключительный этап биосинтеза данной ароматической аминокислоты состоит из нескольких, катализируемых индивидуальными ферментами стадий. Было обнаружено, что у одного из мутантов E. coli с нарушенным биосинтезом триптофана добавление данной аминокислоты (являющейся конечным продуктом этого биосинтетического пути) резко тормозит накопление одного из предшественников – индол глицерофосфата в клетках. Уже тогда было высказано предположение, что триптофан ингибирует активность какого-то фермента, катализирующего образование индол глицерофосфата. Несколько позднее было четко установлено, что таким чувствительным к триптофану ферментом является антранилатсинтетаза, которая катализирует более раннюю реакцию триптофанового пути – образование антраниловой кислоты из хоризмовой кислоты и глутамина. Этот факт был экспериментально обоснован в опыте, когда добавление триптофана в клеточные экстракты E. coli, содержащие фермент антранилатсинтетазу и его субстраты (хоризмат и глутамин), приводило к резкому ингибированию образования антранилата. Более того, было однозначно продемонстрировано, что активность антранилатсинтетазы подавляется только триптофаном и никакие другие метаболиты клетки подобного действия не оказывают.

Благодаря этому явлению у микроорганизмов предотвращается перепроизводство низкомолекулярных промежуточных продуктов обмена, таких, как аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды. Как правило, субстрат ингибируемого фермента резко отличается от конечного продукта - ингибитора и это обстоятельство позволяет считать, что конечный продукт соединяется не с активным центром фермента, а со специальным регуляторным или аллостерическим (от греч. «аллос» – другой, «стерос» – пространственный), центром. Присоединение конечного продукта к аллостерическому центру фермента сопровождается утратой нормальной каталитической активности вследствии конформационных изменений структуры белковой молекулы.

По сравнению с индукцией и репрессией ретроингибирование это инструмент быстрого и точного регулирования метаболитических процессов.

Ретроингибирование является крайне нежелательным явлением при промышленном получении тех или иных интересующих человека клеточных метаболитов, т.к. препятствует их накоплению в высоких концентрациях, что требует использования установок большего объема и усложняет процесс их выделения и очистки. А это в свою очередь увеличивает себестоимость продукции. Существует несколько подходов, позволяющих снять или значительно уменьшить эффект ретроингибирования. Один из них состоит в том, что целевой продукт (ингибитор), удаляют. Например, если он является эндометаболитом, то создаются условия для его ухода из клетки в культуральную жидкость, например за счет повышения проницаемости клеточных оболочек. Если целевой продукт является экзометаболитом (аминокислоты, антибиотики), то его удаляют из культуральной жидкости, например, переводя в нерастворимое состояние (осадок). Второй подход состоит в том, что на стадии синтеза продукта в культуральную жидкость добавляют вещество-промежуточный метаболит, синтез которого блокируется конечным продуктом (см. синтез триптофана). Недостатком этого подхода является то, что такой предшественник не всегда может быть получен дешево и в больших количествах. На практике, если возможно, обычно применяют оба подхода.

Другие подходы связаны с использованием методов мутагенеза-селекции и генной инженерии. Например, при мутационном изменении аллостерического центра (центра взаимодействия с ингибитором) чувствительность к ингибитору утрачивается и фермент сохраняет свою активность при высоких концентрациях конечного продукта, что позволяет создать более высокопродуктивные штаммы микроорганизмов-продуцентов. Более сложный вариант данного подхода реализуется при микробиологическом получении лизина (см. синтез лизина).

Таким образом, образование в печени гликогена из молочной кислоты, по- видимому, обеспечивает важную связь между метаболизмом в мышцах и в печени. При участии печени гликоген из мышц превращается в доступный сахар крови, а этот сахар в свою очередь превращается в мышечный гликоген. Следовательно, в организме существует замкнутый цикл превращений молекул глюкозы... Было показано, что адреналин ускоряет эти реакции в направлении от гликогена мышц к гликогену печени... В то же время инсулин ускоряет реакции в направлении от глюкозы крови к мышечному гликогену.

К. Ф. Кори и Г. Т. Кори, из статьи в журнале Biological Chemistry , 1929

15. ПРИНЦИПЫ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА

Регуляция реакций метаболизма составляет основное содержание исследований в биохимии, и это одна из наиболее замечательных способностей живой клетки. Среди тысяч ферментативных реакций, происходящих в клетке, возможно, нет ни одной, которая в том или ином виде не подвергалась бы регуляции. Хотя в учебниках принято (да это и полезно) подразделять метаболический процесс на отдельные «пути», выполняющие определенные функции в жизнеобеспечении клетки, в самой клетке подобного разделения не существует. Более того, каждый путь, обсуждаемый в этой книге, неразрывно связан со всеми другими клеточными процессами, что показано с помощью многомерной сети реакций (рис. 15-1). Например, в гл. 14 мы обсуждали три возможных пути превращения глюкозо-6-фосфата в клетках печени: участие в гликолизе для накопления АТР, участие в пентозофосфатном пути для получения NADPH и пентозофосфатов, а также гидролиз до глюкозы и фосфата для пополнения запасов глюкозы в крови. Но на самом деле существует ряд других возможных путей превращения глюкозо-6-фосфата; он может, например, использоваться для синтеза других сахаров, таких как глюкозамин, галактоза, галактозамин, фукоза и нейраминовая кислота, участвовать в гликозилировании белков или частично разлагаться, поставляя ацетил-СоА для синтеза жирных кислот и стеринов. Например, бактерия Escherichia coli использует глюкозу для синтеза углеродных скелетов абсолютно всех своих молекул. Когда клетка направляет глюкозо-6-фосфат по одному из путей, это оказывает влияние на все остальные пути, в которых это вещество является предшественником или интермедиатом. Любое изменение в распределении глюкозо-6-фосфата в одном метаболическом пути прямо или косвенно влияет на его участие во всех других путях.

Подобные изменения в распределении метаболитов часто случаются в жизни клетки. Луи Пастер первым описал значительное увеличение потребления глюкозы (более чем в 10 раз) культурой дрожжей при переходе от аэробных условий к анаэробным. Это явление, называемое эффектом Пастера, не сопровождается какими-либо заметными колебаниями концентрации АТР или какого-то другого вещества из сотен интермедиатов и продуктов метаболизма глюкозы. Похожие изменения наблюдаются в клетках скелетных мышц бегуна на спринтерской дистанции. Клетки обладают потрясающей способностью одновременно и экономно осуществлять все эти взаимосвязанные метаболические превращения и получать каждый продукт в строго определенном количестве и в строго определенный момент времени при изменяющихся условиях внешней среды.

Рис. 15-1. Трехмерная сеть реакций метаболизма. Типичная эукариотическая клетка способна к синтезу около 30 000 различных белков, катализирующих тысячи реакций, в которых образуются сотни метаболитов — многие задействованы в нескольких метаболических путях. Иллюстрация взята из базы данных KEGG PATHWAY (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map0ll00.html). Каждую область можно рассмотреть более подробно, вплоть до уровня отдельных ферментов и интермедиатов.

В этой главе мы проиллюстрируем основные принципы регуляции метаболизма на примере метаболизма глюкозы. Мы начнем с рассмотрения общей роли регуляции в достижении метаболического гомеостаза и познакомимся с теорией контроля метаболизма, на основе которой можно проводить количественный анализ сложных метаболических процессов. Далее мы остановимся на особенностях регуляции отдельных ферментов метаболизма глюкозы и рассмотрим каталитическую активность ферментов, участвующих в гликолизе и глюконеогенезе, описанных в гл. 14. Обсудим также каталитические и регуляторные свойства ферментов, участвующих в синтезе и разрушении гликогена, одного из наиболее изученных примеров регуляции метаболизма. Выбрав для иллюстрации принципов метаболической регуляции метаболизм углеводов, мы искусственно отделили его от метаболизма жирных кислот. На самом деле эти два процесса в клетке очень тесно связаны, как мы увидим в гл. 23.

15.1. Регуляция метаболических путей

Реакции катаболизма в метаболизме гликогена обеспечивают энергию, необходимую для преодоления «сил» энтропии, а реакции анаболизма приводят к образованию исходных молекул для биосинтеза и запасанию метаболической энергии. Эти процессы настолько важны для жизнедеятельности клеток, что в ходе эволюции возникли очень сложные регуляторные механизмы, обеспечивающие передвижение метаболитов по правильным путям, в нужном направлении и с необходимой скоростью с тем, чтобы полностью удовлетворять текущие нужды клетки или организма; при изменении внешних условий корректируется скорость превращений метаболитов в соответствующих метаболических путях.

Внешние же условия действительно меняются, иногда довольно сильно. При большой физической нагрузке потребность мышц в АТР может вырасти за считанные секунды в сотни раз. Доступность кислорода может снизиться из-за гипоксии (ухудшения доставки кислорода к тканям) или ишемии (уменьшения кровотока к тканям). Соотношение углеводов, жиров и белков в пище различается, и богатые энергией питательные вещества поступают в организм нерегулярно, в результате чего между приемами пищи и при голодании возникает необходимость коррекции происходящих метаболических процессов. Огромные количества энергии и молекул требуются для биосинтеза, например, при заживлении ран.

Клетки и организмы существуют в динамическом стационарном состоянии

Богатые энергией молекулы, такие как глюкоза, поглощаются клеткой, а отходы метаболизма, например, СO 2 , покидают ее, но при этом масса и состав клетки, отдельного органа или взрослого животного практически не меняются во времени; клетки и организмы существуют в динамическом стационарном состоянии, но никак не в равновесии с окружающей средой. Субстрат для каждой реакции метаболического пути поступает от предыдущей реакции с такой же скоростью, с какой он далее превращается в продукт. Другими словами, хотя скорость (v ) потока вещества (или просто — поток ) на данной стадии метаболизма может быть высокой и сильно изменяться, концентрация субстрата остается постоянной. Для двухстадийной реакции

при v 1 = v 2 концентрация постоянна. Например, изменение скорости поступления глюкозы из различных источников в кровь компенсируется изменением v 2 всасывания глюкозы из крови в ткани, таким образом, концентрация глюкозы в крови поддерживается около 5 мМ. Это гомеостаз на молекулярном уровне. У человека нарушение механизмов гомеостаза часто бывает причиной заболеваний. Например, при сахарном диабете регуляция концентрации глюкозы в крови нарушена из-за недостатка инсулина или нечувствительности к нему, что и влечет за собой пагубные последствия для здоровья.

Когда внешние воздействия не ограничиваются просто временным влиянием или когда клетка одного типа превращается в клетку другого типа, регулирование состава клетки и метаболизма может оказаться более значительным и потребовать заметных и продолжительных изменений в распределении энергии и исходных веществ для синтеза, чтобы аккуратно осуществить этот переход. Представьте себе, например, процесс дифференцировки стволовой клетки костного мозга в эритроцит. Исходная клетка содержит ядро, митохондрии и мало или вовсе не содержит гемоглобина, в то время как в полностью дифференцированном эритроците гемоглобина огромное количество, но ни ядра, ни митохондрий нет. Состав этой клетки постоянно изменялся в ответ на приходящие извне сигналы, и соответственно менялся и метаболизм. Дифференцировка клеток требует точной регуляции концентраций клеточных белков.

В ходе эволюции возник замечательный набор регуляторных механизмов, позволяющих поддерживать гомеостаз на уровне молекул, клеток и целых организмов. Значение регуляции метаболизма для организма отражается в относительном количестве генов, кодирующих элементы регуляторного аппарата: у человека около 4000 генов (около 12% всех генов) кодируют регуляторные белки, в том числе разнообразные рецепторы, регуляторы экспрессии генов и около 500 различных протеинкиназ! Регуляторные механизмы действуют в разном временном диапазоне (от секунд до суток) и отличаются по чувствительности к изменениям внешней среды. Во многих случаях эти механизмы перекрываются: один и тот же фермент может быть объектом регуляции в нескольких регуляторных механизмах.

Регулируется не только количество ферментов, но и их каталитическая активность

Интенсивность ферментативного процесса может регулироваться как путем изменения количества ферментов, так и путем модуляции каталитической активности присутствующих молекул фермента. Подобные превращения происходят во временном диапазоне от нескольких миллисекунд до нескольких часов и служат ответом на внутриклеточный или внешний сигнал. Очень быстрые аллостерические изменения ферментативной активности обычно инициируются на месте путем изменения локальной концентрации небольших молекул субстрата данного метаболического пути (в реакциях гликолиза — глюкозы), продукта пути (АТР при гликолизе) или ключевого метаболита или кофактора (такого, как NADH ), что связано с метаболической способностью клетки. Вторичные мессенджеры (такие, как циклический АМР и Са 2+), образующиеся внутри клеток в ответ на внеклеточные сигналы (гормоны, цитокины и т. п.), также опосредуют аллостерическую регуляцию, но несколько медленнее влияя на механизмы передачи сигнала (см. гл. 12).

Внеклеточные сигналы (рис. 15-2, Ф) могут быть гормональными (инсулин или адреналин), нейрональными (ацетилхолин) или передаваться с помощью факторов роста или цитокинов. Количество данного фермента в клетке определяется соотношением между скоростями его синтеза и деградации. Скорость синтеза регулируется путем активации (в ответ на какой-то внешний сигнал) фактора транскрипции (рис. 15-2, (D ; подробности см. в гл. 28). Факторы транскрипции — это ядерные белки, которые после активации связываются со специфическими участками ДНК (респонсивными элементами) вблизи области промотора гена (точки начала транскрипции) и активируют или подавляют транскрипцию данного гена, что приводит к увеличению или уменьшению продукции соответствующего белка. Активация фактора транскрипции часто происходит в результате его связывания со специфическим лигандом, а иногда бывает вызвана его фосфорилированием или дефосфорилированием. Каждый ген контролируется одним или несколькими респонсивными элементами, которые распознаются специфическими факторами транскрипции. Некоторые гены содержат несколько респонсивных элементов и, следовательно, контролируются несколькими различными факторами транскрипции, реагирующими на несколько различных сигналов. Группы генов, кодирующих белки, действие которых взаимосвязано, как в случае ферментов гликолиза или глюконеогенеза, часто содержат респонсивные элементы с одинаковой последовательностью, так что один и тот же сигнал, действующий через определенный фактор транскрипции, включает или выключает всю группу генов одновременно. В разд. 15.3 обсуждается регуляция метаболизма углеводов под действием специфических факторов транскрипции.

Устойчивость молекул мРНК к рибонуклеа- зам (рис. 15-2, (D ) может быть различной, так что количество мРНК данного вида в клетке — функция скоростей ее синтеза и деградации (гл. 26). Наконец, скорость трансляции мРНК на рибосомах (рис. 15-2, (4)) также регулируется и зависит от нескольких факторов, описанных подробно в гл. 27.

Рис. 15-2. Факторы, влияющие на активность ферментов. Общая активность фермента может меняться из-за изменения числа молекул данного (количества) фермента в клетке, его эффективной активности в определенном клеточном отделе ((1)-(6)) или модуляции активности существующих молекул фермента как подробно описано в тексте. Активность конкретного фермента определяется сочетанием этих факторов.

Обратите внимание, что увеличение продукции мРНК в n раз не всегда означает n -кратное увеличение синтеза соответствующего белка.

Образовавшаяся молекула белка существует ограниченное время, а именно, от нескольких минут до многих дней (табл. 15-1). Скорость деградации ферментов (рис. 15-2, (5)) также различна и определяется внутриклеточными условиями. Некоторые белки подвергаются деградации в протеасомах (см. гл. 28) в результате ковалентного связывания с убиквитином (вспомните белок циклин; см. рис. 12-46). Быстрый оборот (синтез с последующей деградацией) сопряжен с большими энергетическими затратами, однако белки с меньшим периодом полужизни (время, за которое остается половина первоначального количества вещества) могут достичь нового стационарного состояния по своему содержанию быстрее белков, время полужизни которых велико, и выигрыш от такой быстрой реакции должен уравновешивать или быть больше энергетических затрат клетки.

Таблица 15-1. Примерное время полужизни белков в органах млекопитающих

Еще один фактор, влияющий на эффективную активность фермента, — это доступность его субстрата (рис. 15-2, (6)). Гексокиназа из мышц не может действовать на глюкозу, пока этот сахар не поступит из крови в клетки мышц, а скорость проникновения глюкозы в клетки зависит от молекул-переносчиков (см. табл. 11-3) в плазматической мембране. Внутри клетки некоторые ферменты и ферментные системы содержатся в различных ограниченных мембраной компартментах; доставка субстратов в эти отделы может быть лимитирующим фактором для фермента.

Благодаря наличию этих нескольких механизмов регуляции ферментативной активности клетки способны существенно изменять набор ферментов в ответ на изменение условий метаболизма. У позвоночных наиболее приспосабливаемым органом является печень; например, замена богатой углеводами пищи на пищу с высоким содержанием липидов влияет на транскрипцию сотен генов и, следовательно, синтез сотен белков. Подобные глобальные изменения в экспрессии генов можно оценить на количественном уровне с помощью ДНК-микрочипов (см. рис. 9-22), позволяющих анализировать весь набор мРНК данного типа клеток или органов (транскриптом), или с помощью двумерного гель-электрофореза (см. рис. 3-21) — метода изучения всех белков данного типа клеток или конкретного органа (протеом). Оба этих метода очень полезны при исследованиях регуляции метаболизма. Изменения протеома часто влекут за собой изменения всего ансамбля низкомолекулярных метаболитов — метаболома.

После того как в результате действия регуляторных механизмов, контролирующих синтез и деградацию белка, в клетке образовалось определенное количество каждого фермента, активность этих ферментов и далее подвержена регуляции: путем изменения концентрации субстратов; путем воздействия аллостерических эффекторов; путем ковалентной модификации; или путем связывания регуляторных белков. Все эти процессы могут изменять активность отдельных молекул фермента (рис. 15-2, (7)-(10)).

Все ферменты чувствительны к концентрации своих субстратов (рис. 15-2, (7)). Вспомните, что в простейшем случае (в условиях кинетики Михаэлиса-Ментен) начальная скорость реакции равна половине максимальной скорости при концентрации субстрата, равной значению К м (т. е. при полунасыщении фермента субстратом). При уменьшении концентрации субстрата скорость реакции также уменьшается, а при «К м скорость реакции линейным образом зависит от . Это важно помнить, поскольку внутриклеточная концентрация субстрата часто близка к К м или ниже этого значения. Например, активность гексокиназы зависит от концентрации глюкозы, а внутриклеточная концентрация глюкозы изменяется с концентрацией глюкозы в крови. Как мы увидим далее, различным формам (изоформам) гексокиназы соответствуют разные К м, и, следовательно, присутствие различных изоформ гексокиназы зависит от внутриклеточной концентрации глюкозы, что имеет определенное физиологическое значение.

Пример 15-1. Активность переносчика глюкозы

Если для переносчика глюкозы в печени (GLU Т2) Кt (эквивалент К м) = 40 мМ, определите изменение скорости поступления (потока) глюкозы в гепатоциты при повышении концентрации глюкозы в крови от 3 до 10 мМ.

Решение. Для определения начальной скорости поступления глюкозы используем уравнение 11-1 (т. 1, с. 555).

При 3 мМ глюкозы

V 0 = V m ах (3 мМ)/(40 мМ + 3 мМ) = V m ах (3 мМ/43 мМ) = 0,07 V m ах При 10 мМ глюкозы

V 0 = V m ах (10 мМ)/(40 мМ + 10 мМ) = V m ах (10 мМ/50 мМ) = 0,20 V m ах

Таким образом, если концентрация глюкозы в крови увеличилась от 3 до 10 мМ, то это значит, что скорость потока глюкозы в гепатоциты повысилась почти в 3 раза (0,20/0,07).

Ферментативная активность может увеличиваться или уменьшаться под действием аллостерических эффекторов (рис. 15-2, (8); см. также рис. 6-34). Под влиянием аллостерических эффекторов кинетика реакции обычно вместо гиперболической становится S -образной, или наоборот (например, см. рис. 15-14, б). В наиболее крутой части S -образной кривой небольшие изменения концентрации субстрата или аллостерического эффектора могут значительно влиять на скорость реакции. Как мы обсуждали в гл. 5 (с. 239, т. 1), для описания поведения аллостерических ферментов пользуются коэффициентом кооперативности Хилла, причем большое значение этого коэффициента означает более высокую кооперативность. Для аллостерического фермента с коэффициентом Хилла, равным 4, трехкратное увеличение концентрации субстрата приводит к увеличению скорости реакции от 0,1 Vm ах до 0,9 Vm ах, тогда как для фермента, не обладающего свойством кооперативности (коэффициент Хилла 1; см. табл. 15-2), для такого же изменения ферментативной активности требуется повышение концентрации субстрата в 81 раз!

Ковалентные модификации уже существующего фермента или другого белка (рис. 15-2, (9)) происходят за секунды-минуты с момента поступления сигнала, как правило, внеклеточного. Самая распространенная модификация — это фосфорилирование-дефосфорилирование (рис. 15-3); до половины всех белков в эукариотической клетке при определенных условиях подвергаются фосфорилированию. Фосфорилирование может изменить электростатические свойства активного центра фермента, сместить ингибирующий участок белка подальше от активного центра, повлиять на взаимодействие данного белка с другими молекулами или вызвать конформационные изменения, приводящие к изменениям Vm ах и К м. Для осуществления регуляции необходимо, чтобы после ковалентной модификации клетка могла вернуть белок к его исходному состоянию. Семейство фосфопротеинфосфатаз, некоторые члены которого сами находятся под контролем, катализируют дефосфорилирование белков, которые были фосфорилированы протеинкиназами.

Таблица 15-2. Соотношение между коэффициентом Хилла и влиянием концентрации субстрата на скорость реакции для аллостерических ферментов

Рис. 15-3. Фосфорилирование-дефосфорилирование белка. Протеинкиназы переносят фосфорильную группу от АТР на остатки Ser, Thr или Туr в белке. Протеинфосфатазы удаляют фосфорильную группу в виде P i .

Наконец, регуляция многих ферментов достигается путем связывания с регуляторными белками (рис. 15-2, (10)). Например, сАМР- зависимая протеинкиназа (РКА; см. рис. 12-6) остается неактивной до тех пор, пока в результате связывания сАМР каталитические и регуляторные субъединицы фермента разделены.

Рассмотренные механизмы влияния на скорость определенной реакции метаболического пути не исключают друг друга. Достаточно часто один и тот же фермент подвергается регуляции на уровне транскрипции, а также путем аллостерических механизмов и ковалентного связывания. Сочетание этих механизмов обеспечивает быструю и эффективную регуляцию в ответ на самые разнообразные изменения в клетке и поступающие сигналы.

Для последующего обсуждения полезно рассмотреть изменения ферментативной активности при выполнении двух различных, но, тем не менее, взаимодополняющих функций. Термином метаболическая регуляция будем обозначать процесс, направленный на поддержание гомеостаза на молекулярном уровне, т. е. поддержание определенных клеточных параметров (таких как концентрации метаболитов) даже при изменении потока метаболитов в данном метаболическом пути. Термином метаболический контроль будем называть процессы, ведущие к изменению результата метаболического пути во времени в ответ на некоторые внешние сигналы или изменение условий. Следует сказать, однако, что четкую границу между этими двумя понятиями провести не всегда легко.

Обычно в клетке регулируются реакции, далекие от состояния равновесия

На некоторых стадиях метаболического пути реакции приближаются к состоянию равновесия (рис. 15-4). Общий поток метаболитов в таких реакциях определяется небольшой разницей между скоростями прямой и обратной реакций, которые при приближении к состоянию равновесия имеют близкие значения. Небольшие изменения концентрации субстрата или продукта реакции могут сильно изменить общую скорость процесса и даже его направление. Идентифицировать эти почти равновесные реакции в клетке мы можем, если будем сравнивать величины отношения действующих масс Q с константой равновесия реакции К" eq . Вспомните, что для реакции А + В —> С + D Q = [С]/[А][В]. Считается, что, когда Q и К" eq различаются лишь на 1-2 порядка, реакция близка к равновесию. Например, это наблюдается для шести из 10 реакций гликолиза (табл. 15-3).

Рис. 15-4. Равновесные и неравновесные стадии метаболизма. В клетке стадии (2) и (3) данного пути почти равновесны; скорости их прямых реакций лишь немного превышают скорости обратных реакций, так что общая скорость (10) довольно низкая, а изменение свободной энергии ∆G′ для каждой из этих стадий близко к нулю. Повышение внутриклеточной концентрации метаболитов С или D может изменить направление этих стадий. Стадия (1) в клетке далека от равновесия — скорость прямой реакции намного превосходит скорость обратной реакции. Общая скорость стадии (1) (10) много больше скорости обратной реакции (0,01) и в стационарном состоянии равна скоростям стадий (2) и (3). Стадия (1) характеризуется большим отрицательным значением ∆G′.

Многие реакции в клетке, однако, далеки от равновесия. Например, для реакции гликолиза, катализируемой фосфофруктокиназой-1 (РРК-1), К" eq ≈ 1000, а для типичной клетки в стационарном состоянии Q = [фруктозо-1,6-бисфосфат][АD Р]/ [фруктозо-6-фосфат][АТР]) ≈ 0,1 (табл. 15-3). Именно благодаря тому, что эта реакция так далека от равновесия, во внутриклеточных условиях данный процесс экзергонический и протекает в прямом направлении. Эта реакция далека от равновесия, поскольку при обычных внутриклеточных концентрациях субстрата, продукта и эффектора скорость превращения фруктозо-6- фосфата в фруктозо-1,6-бисфосфат ограничена активностью PFK -1, что регулируется числом молекул PFK -1 и действием эффекторов. Таким образом, скорость прямого процесса совпадает со скоростью общего потока интермедиатов гликолиза в других реакциях данного пути, а скорость обратного потока в реакции с участием PFK -1 практически равна нулю.

Таблица 15-3. Константы равновесия, отношения действующих масс и изменения свободной энергии ферментативных реакций при метаболизме углеводов

* Для простоты считают, что все реакции, для которых ∆G′ <6, близки к равновесию.

Клетка не может допустить, чтобы реакции с большими значениями констант равновесия приближались к равновесию. Если при обычных клеточных концентрациях фруктозо-6-фосфата, АТР и ADP (несколько миллимолей) катализируемая PFK -1 реакция могла бы достигать равновесия, то концентрация фруктозо-1,6-бисфосфата оказалась бы в молярном диапазоне, что привело бы к гибели клетки из-за высокого осмотического давления.

Рассмотрим другой пример. Если в клетке реакция АТР —> ADP + Рi могла бы приблизиться к равновесию, для этой реакции изменение свободной энергии ∆G′ —> 0 (∆Gp ; см. пример 13-2, с. 31); в результате АТР утратил бы свой высокий потенциал переносчика фосфатных групп, который так необходим клетке. Поэтому очень важно, чтобы ферменты, катализирующие разложение АТР и другие экзергонические реакции в клетке, были подвержены регуляции, т. е. при изменении метаболических процессов в результате внешних воздействий реакции с участием этих ферментов корректировались таким образом, чтобы концентрация АТР оставалась гораздо выше равновесного уровня. При подобных изменениях метаболизма происходит корректировка активностей ферментов во всех взаимосвязанных метаболических путях, что не позволяет критическим стадиям достичь равновесия. Поэтому неудивительно, что многие ферменты (такие как PFK -1), катализирующие реакции с большим отрицательным изменением свободной энергии, тонко регулируются множеством различных способов. Эта регуляция происходит настолько сложным путем, что при изучении свойств только одного фермента метаболического пути нельзя определить, насколько большое влияние оказывает этот фермент на ход процесса в целом; для этого надо привлечь теорию контроля метаболизма, к которой мы обратимся в разд. 15.2.

Адениновые нуклеотиды играют особую роль в регуляции метаболизма

Возможно, вторая по важности задача клетки (после защиты от повреждений ДНК) — это поддержание постоянных запасов АТР. Многие АТР- зависимые ферменты имеют К м между 0,1 и 1 мМ, а нормальная концентрация АТР в клетке составляет 5 мМ. Если концентрация АТР была бы значительно ниже, эти ферменты не могли бы достичь насыщения своим субстратом (АТР), в результате чего снизилась бы скорость сотен реакций, происходящих с участием АТР (рис. 15-5). Клетка, вероятно, не смогла бы пережить такого кинетического воздействия на столь большое число реакций.

Кроме того, уменьшение концентрации АТР имеет важные термодинамические последствия. Поскольку при выполнении работы в клетке АТР превращается в ADP или АМР, соотношение / оказывает глубокое влияние на течение всех реакций, в которых задействованы эти кофакторы. Это же относится и к другим кофакторам— NADH /NAD + и NADPH /NADP + .

Рис. 15-5. Влияние концентрации АТР на начальную скорость реакции, катализируемой типичным АТР- зависимым ферментом. На основании этих экспериментальных данных для АТР К м ≈ 5 мМ. В тканях животных концентрация [АТР] ≈ 5 мМ.

Например, рассмотрим реакцию, катализируемую гексокиназой:

Заметьте, что это выражение верно только в том случае, когда исходные вещества и продукты реакции находятся в равновесных концентрациях, при которых ∆G′ = 0. При любых других концентрациях ∆G′ ≠ 0. Вспомните (гл. 13), что отношение концентраций продуктов реакции к концентрациям субстратов (отношение действующих масс Q определяет величину и знак ∆G′ и, следовательно, движущую силу (∆G′) реакции:

Поскольку изменение этой движущей силы влияет на все реакции с участием АТР, в процессе эволюции организмы выработали регуляторные механизмы, ответственные за поддержание соотношения /.

Концентрация АМР гораздо чувствительнее к энергетическому состоянию клетки, чем концентрация АТР. Обычно в клетках концентрация АТР (5-10 мМ) гораздо выше, чем концентрация АМР (<0,1 мМ). При расходовании АТР, например при мышечном сокращении, АМР образуется в результате двустадийного процесса. Сначала при гидролизе АТР образуется ADP , а затем в результате действия аденилаткиназы — АМР:

2ADP АМР + АТР

При уменьшении концентрации АТР на 10% относительное увеличение концентрации АМР более значительно, чем для ADP (табл. 15-4). Поэтому неудивительно, что многие регуляторные процессы связаны именно с концентрацией АМР. Важную роль как медиатор регуляции играет AMP -зависимая протеинкиназа, которая при повышении концентрации АМР начинает фосфорилировать ключевые белки, регулируя тем самым их активность. Увеличение [АМР] может быть связано с недостаточным поступлением питательных веществ или с большой физической нагрузкой. Действие АМР-зависимой протеинкиназы (не путайте с сАМР-зависимой протеинкиназой, см. разд. 15.5) усиливает транспорт глюкозы, активирует гликолиз и окисление жирных кислот, но в то же время подавляет такие энергозатратные процессы, как синтез жирных кислот, холестерина и белков (рис. 15-6). В гл. 23 мы подробнее обсудим этот фермент и механизм его действия в указанных процессах.

Таблица 15-4. Относительные изменения концентраций АТР и АМР при расходовании АТР или функциональных групп

Рис. 15-6. Роль AMP -зависимой протеинкиназы (АМРК) в метаболизме жиров и углеводов. Во время физических нагрузок АМРК активируется в ответ на увеличение концентрации АМР или уменьшение концентрации АТР сигналами от симпатической нервной системы (СНС) или гормонов жировой ткани (лептина и адипонектина, подробнее см. гл. 23). Активированная АМРК фосфорилирует ключевые белки и тем самым регулирует метаболизм во многих тканях, подавляя такие энергозатратные процессы, как синтез гликогена, жирных кислот и холестерина; направляет обмен веществ вне печени на использование жирных кислот в качестве топливных молекул; а в печени запускает глюконеогенез для обеспечения мозга глюкозой. В гипоталамусе АМРК стимулирует пищевое поведение так, чтобы организм получил больше питательных веществ.

Наряду с АТР в клетке в необходимых концентрациях должны присутствовать сотни интермедиатов метаболизма. Например, интермедиаты гликолиза дигидроксиацетонфосфат и 3-фосфоглицерат служат предшественниками триацилглицеринов и серина соответственно. При необходимости скорость гликолиза должна корректироваться таким образом, чтобы обеспечить необходимое количество этих веществ без снижения уровня образования АТР. Эта же закономерность справедлива для других важных кофакторов, таких как NADH и NADPH : изменение отношения их действующих масс (т. е. отношение концентрации восстановленной формы кофактора к концентрации его окисленной формы) оказывает очень сильное влияние на метаболизм.

Конечно, на эволюционное развитие регуляторных механизмов влияли также приоритеты, возникающие в жизнедеятельности целого организма. В головном мозге млекопитающих запасы энергии практически отсутствуют, поэтому деятельность мозга полностью зависит от поступления глюкозы по кровотоку. Когда уровень глюкозы крови уменьшается в 2 раза по сравнению с нормой (4-5 мМ), происходит нарушение мозговой деятельности, а 5-кратное снижение уровня глюкозы крови приводит к состоянию комы и к смерти. Поддерживать уровень глюкозы крови в норме помогают гормоны инсулин и глюкагон, выделяющиеся при повышенном и пониженном содержании глюкозы соответственно; эти гормоны запускают серию метаболических реакций, направленных на нормализацию уровня глюкозы.

Кроме того, в ходе эволюции должно было осуществляться и другое селективное воздействие, приведшее к отбору регуляторных механизмов, направленных на решение вполне определенных задач.

1. Обеспечение максимальной эффективности использования энергии путем предотвращения одновременного протекания реакций противоположно направленных метаболических путей (например, гликолиза и глюконеогенеза).

2. Распределение метаболитов между альтернативными метаболическими путями (такими как гликолиз и пентозофосфатный путь).

3. Выбор наиболее подходящего источника энергии для решения текущих задач организма (глюкоза, жирные кислоты, гликоген или аминокислоты).

4. Остановка путей биосинтеза при накоплении его продуктов.

В последующих главах представлено множество примеров регуляторных механизмов каждого типа.

Краткое содержание раздела 15.1. Регуляция метаболических путей

■ В клетке с активным метаболизмом, находящейся в стационарном состоянии, интермедиаты метаболизма образуются и расходуются с одинаковой скоростью. Если в результате каких-либо воздействий скорость образования или расходования метаболита изменяется, в клетке происходит компенсаторное изменение активностей ферментов, приводящее к восстановлению стационарного состояния.

■ Клетки регулируют свой метаболизм с помощью различных механизмов во временном диапазоне от миллисекунд до нескольких суток, изменяя активность уже существующих ферментов или количество синтезируемых молекул специфического фермента.

■ Различные сигналы могут активировать или инактивировать факторы транскрипции, которые регулируют экспрессию генов в ядре клетки. Изменения в транскриптоме приводят к изменениям в протеоме и, в итоге, в метаболоме клетки или ткани.

■ В многостадийных процессах, таких как гликолиз, некоторые реакции в стационарном состоянии близки к равновесию; скорости этих реакций контролируются концентрацией субстрата и уменьшаются и увеличиваются при ее изменении. Другие реакции далеки от равновесия; обычно они контролируют потоки веществ целиком в данном метаболическом пути.

■ Регуляторные механизмы направлены на поддержание в клетках практически постоянного уровня ключевых метаболитов, таких как АТР и NADH , или глюкозы крови; при изменении потребностей организма используются запасы гликогена.

13.4.1. Реакции цикла Кребса относятся к третьей стадии катаболизма питательных веществ и происходят в митохондриях клетки. Эти реакции относятся к общему пути катаболизма и характерны для распада всех классов питательных веществ (белков, липидов и углеводов).

Главной функцией цикла является окисление ацетильного остатка с образованием четырёх молекул восстановленных коферментов (трёх молекул НАДН и одной молекулы ФАДН2 ), а также образование молекулы ГТФ путём субстратного фосфорилирования. Атомы углерода ацетильного остатка выделяются в виде двух молекул СО2 .

13.4.2. Цикл Кребса включает 8 последовательных стадий, обращая особое внимание на реакции дегидрирования субстратов:

Рисунок 13.6. Реакции цикла Кребса, включая образование α-кетоглутарата

а) конденсация ацетил-КоА с оксалоацетатом , в результате которой образуется цитрат (рис.13.6, реакция 1); поэтому цикл Кребса называют также цитратным циклом . В этой реакции метильный углерод ацетильной группы взаимодействует с кетогруппой оксалоацетата; одновременно происходит расщепление тиоэфирной связи. В реакции освобождается КоА-SH, который может принять участие в окислительном декарбоксилировании следующей молекулы пирувата. Реакцию катализирует цитратсинтаза , это – регуляторный фермент, он ингибируется высокими концентрациями НАДН, сукцинил-КоА, цитрата.

б) превращение цитрата в изоцитрат через промежуточное образование цис-аконитата. Образующийся в первой реакции цикла цитрат содержит третичную гидроксильную группу и не способен окисляться в условиях клетки. Под действием фермента аконитазы идёт отщепление молекулы воды (дегидратация), а затем её присоединение (гидратация), но другим способом (рис.13.6, реакции 2-3). В результате данных превращений гидроксильная группа перемещается в положение, благоприятствующее её последующему окислению.

в) дегидрирование изоцитрата с последующим выделением молекулы СО2 (декарбоксилированием) и образованием α-кетоглутарата (рис. 13.6, реакция 4). Это – первая окислительно-восстановительная реакция в цикле Кребса, в результате которой образуется НАДН. Изоцитратдегидрогеназа , катализирующая реакцию, - регуляторный фермент, активируется АДФ. Избыток НАДН ингибирует фермент.

Рисунок 13.7. Реакции цикла Кребса, начиная с α-кетоглутарата.

г) окислительное декарбоксилирование α-кетоглутарата , катализируется мультиферментным комплексом (рис. 13.7, реакция 5), сопровождается выделением СО2 и образованием второй молекулы НАДН. Эта реакция аналогична пируватдегидрогеназной реакции. Ингибитором служит продукт реакции – сукцинил-КоА.

д) субстратное фосфорилирование на уровне сукцинил-КоА, в ходе которого энергия, освобождающаяся при гидролизе тиоэфирной связи, запасается в форме молекулы ГТФ. В отличие от окислительного фосфорилирования, этот процесс протекает без образования электрохимического потенциала митохондриальной мембраны (рис. 13.7, реакция 6).

е) дегидрирование сукцината с образованием фумарата и молекулы ФАДН2 (рис. 13.7, реакция 7). Фермент сукцинатдегидрогеназа прочно связан с внутренней мембраной митохондрии.

ж) гидратация фумарата , в результате чего в молекуле продукта реакции появляется легко окисляемая гидроксильная группа (рис. 13.7, реакция 8).

з) дегидрирование малата , приводящее к образованию оксалоацетата и третьей молекулы НАДН (рис.13.7, реакция 9). Образующийся в реакции оксалоацетат может вновь использоваться в реакции конденсации с очередной молекулой ацетил-КоА (рис. 13.6, реакция 1). Поэтому данный процесс носит циклический характер.

13.4.3. Таким образом, в результате описанных реакций подвергается полному окислению ацетильный остаток СН3 -СО- . Количество молекул ацетил-КоА, превращаемых в митохондриях в единицу времени, зависит от концентрации оксалоацетата. Основные пути увеличения концентрации оксалоацетата в митохондриях (соответствующие реакции будут рассмотрены позднее):

13.4.4. Некоторые метаболиты цикла Кребса могут использоваться для синтеза структурных блоков для построения сложных молекул. Так, оксалоацетат может превращаться в аминокислоту аспартат, а α–кетоглутарат – в аминокислоту глутамат. Сукцинил-КоА принимает участие в синтезе гема – простетической группы гемоглобина. Таким образом, реакции цикла Кребса могут участвовать как в процессах катаболизма, так и анаболизма, то есть цикл Кребса выполняет амфиболическую функцию (см. 13.1).