Гост на определение охратоксина а. Зерно и продукты его переработки, комбикормаопределение охратоксина а методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг

Границы относительной погрешности (показатель точности) (±d ), %, Р = 0,95

Стандартное отклонение повторяемости (s r ), %

Предел повторяемости (r ), %

Полнота извлечения веществ, %

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, реактивы и материалы

4.1 . Средства измерений

4.2 . Вспомогательное оборудование


Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С или аналогичный	ТУ 64-1-2451
Ротационный испаритель ИР-1М с ловушкой или аналогичный	ТУ 25-11917
Электрошкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры ±2,5 в интервале от 50 до 350 °С	ТУ 16-531.639
Холодильник бытовой
Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3А или аналогичная рН-метр	ТУ 46-22-236-79
Магнитная мешалка типа ММ 5 с перемешивающим стержнем	ТУ 25-11.834-80
Колбы плоскодонные конические на 250 см 3 с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32	ГОСТ 10394-74
Флаконы стеклянные завинчивающиеся из темного стекла (вайл), объемом 7 см 3
Колбы мерные, вместимостью 100, 500, 1000 см 3 тип 2-100-2,2-500-2
Воронки лабораторные
Колбы грушевидные на 10 см 3 с НШ 14,5, тип ГрКШ-10-14/23	ГОСТ 10394-72

4.3 . Реактивы и материалы


Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, 2-водный, чда
Натрий хлорид, хч
Ацетонитрил, осч, сорт 0
Метанол, осч
Кислота фосфорная, осч	ТУ 2612-014-00203677-97
Кислота уксусная ледяная, хч
Толуол, чда
Иммуноаффинные колонки Ochraprep (R-Biopharm, Великобритания)

. Подготовка к выполнению измерений

5.1 . Приготовление стандартных растворов охратоксина А

Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина А - 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина А массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см 3 , приливают 50 см 3 смеси толуол-уксусная кислота (98:2 % об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм (Д 333). Концентрацию раствора вычисляют по формуле:

Далее 5 см 3 стандартного раствора охратоксина А с концентрацией 10 нг/мкл разбавляют смесью толуол-уксусная кислота (98: 2 % об.) до объема 100 см 3 , получая рабочий раствор с концентрацией 0,5 нг/мкл.

Для приготовления рабочих растворов охратоксина А с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают соответственно 50, 500 и 1000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл, упаривают досуха и растворяют в 5 см 3 подвижной фазы.

Раствор хранения охратоксина А содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) до одного года и используют для приготовления рабочих стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) в течение 1 месяца.

Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.

5.2 . Приготовление фосфатного буферного раствора, рН = 7,4

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 , добавляют 10 - 20 см 3 дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.

5.3 . Приготовление смесей растворителей

Толуол -уксусная кислота (98:2 % об .).

В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 20 см 3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил -вода (60:40 % об .).

В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 600 см 3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил -вода (60:40 % об .; рН = 3 ,0 ).

В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 600 см 3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят рН смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Метанол -уксусная кислота (98:2 % об .).

В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 20 см 3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

. Отбор и подготовка проб для анализа

6.1 . Отбор проб

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:

«Зерно. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 13586.3-83 ;

«Крупа. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 26312.1-84 ;

«Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб» ГОСТ 27668-88 ;

«Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию» ГОСТ 8756.0-70 .

Пробы для анализа, представительные по концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.

6.2 . Подготовка проб для анализа

Отобранные пробы измельчают в течение 1 - 2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.

6.2.1 . Экстракция

Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см, добавляют 100 см 3 смеси ацетонитрил-вода (60:40 % об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента». Отбирают 10 см 3 фильтрата и добавляют 90 см фосфатного буферного раствора, рН = 7,4.

6.2.2 . Очистка экстракта

На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, промывают 20 см 3 фосфатного буферного раствора, рН = 7,4. Охратоксин А элюируют 3 см 3 смеси метанол-уксусная кислота (98: 2 % об.).

. Выполнение измерений

7.1 . Приготовление тестового образца

Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).

7.2 . Условия хроматографирования

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - ацетонитрил-вода (60:40 % об.; рН = 3,0); скорость подвижной фазы - 1,5 см 3 /мин.

Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.

Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, рассчитывают массу охратоксина А во вколе с помощью градуировочного графика.

. Обработка результатов измерения

8.1 . Построение градуированной зависимости

Для построения градуировочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина А. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл, что в свою очередь соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина А во вколе. В указанных условиях время удерживания находится для охратоксина А в диапазоне от 4 до 5 мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость площади хроматографического пика от массы охратоксина А во вколе).

8.2 . Оформление результатов

Расчет концентрации охратоксина А в пробе проводится по формуле:

С (охр. А) - концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг;

М - масса навески для анализа, г (25,0);

т - масса охратоксина А, соответствующая введенному в хроматограф объему раствора А, нг;

V 1 - объём раствора для экстракции, см 3 (100);

D - граница абсолютной погрешности:

d - граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл. 1).

Если содержание охратоксина А в пробе менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

* 0,0001 мг/кг - предел обнаружения.

8.3 . Проверка приемлемости результатов параллельных определений

Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R ) определяют на основании предела повторяемости (r ) (табл. 1):

R = 0,01 (r , %) × , мг/кг

Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:

то среднее арифметическое принимают за результат анализа.

При превышении норматива R следует повторить измерения, используя резервные пробы.

. Контроль качества результатов измерений

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют такое количество раствора стандарта охратоксина А, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50 - 100 %. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы (С (отр.А) ) и пробы с добавкой (С ¢ (отр.А) ). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т, д.

Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (С ¢ (охр.А) ), пробы без добавки (С (охр.А) ) и величиной добавки (С доб(охр.А) ) с нормативом оперативного контроля (K ). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия (при Р и

Температура окружающего воздуха от 15 до 25 °С.

Относительная влажность воздуха не более 80 % при 25 °С.

Атмосферное давление 730 - 760 мм рт.ст.

Напряжение электропитания: 210 - 220 В. Частота переменного тока: 45 - 50 Гц.

Охратоксины вырабатываются некоторыми видами грибов Aspergillus и Penicillium . Основными продуцентами являются A.ochraceus и P.viridicatum . Эти грибы встречаются повсеместно. Aspergillus вырабатывает охратоксины при повышенной температуре и влажности, а Penicillium уже при 5ºС. Охратоксины – соединения высокой токсичности, с ярко выраженным тератогенным эффектом.

Охратоксины А,В, и С представляют собой группу близких по структуре соединений, являющихся изокумаринами, связанными с L -фенилаланином пептидной связью. В зависимости от природы радикалов образуются охратоксины различных типов (табл. 2.3.).

Охратоксин А – бесцветное кристаллическое вещество, слабо растворимое в воде, умеренно растворимое в полярных органических растворителях (метанол, хлороформ), а также в водном растворе карбоната натрия. В химически чистом виде он нестабилен и очень чувствителен к воздействию света и воздуха, однако в растворе этанола может сохраняться без изменений в течение длительного времени. В УФ свете обладает зеленой флуоресценцией.

Охратоксин В – кристаллическое вещество, аналог охратоксина А, не содержащий атом хлора. Он примерно в 50 раз менее токсичен, чем охратоксин А. В УФ-свете обладает голубой флуоресценцией.

Охратоксин С – аморфное вещество, этиловый эфир охратоксина А, близок к нему по токсичности, но в качестве природного загрязнителя пищевых продуктов и кормов не обнаружен. В У-свете обладает бледно-зеленой флуоресценцией.

Охратоксины принадлежат к токсичным микотоксинам, обладают высокой токсичностью для печени, почек, тератогенными и иммунодепрессивными свойствами, выраженным гемолитическим эффектом. Из охратоксинов наиболее токсичен охратоксин А (ЛД 50 = 3,4 мг/кг, (однодневные цыплята, перорально)). Он более токсичен, чем афлатоксины. Другие микотоксины этой группы на порядок менее токсичны.

Биохимические, молекулярные, клеточные механизмы действия охратоксинов изучены недостаточно. Известно, что охратоксин А подавляет синтез протеина и метаболизм углеводов, в частности гликоногеноз, путем ингибирования активности фенилаланин – т-РНК – специфического фермента, играющего ключевую роль в начальной стадии синтеза протеина.

Охратоксин А обнаружен в кукурузе, ячмене, пшенице, овсе, ячмене. Важен и опасен тот факт, что при высоком загрязнении кормового зерна и комбикормов охратоксин А обнаруживается в животноводческой продукции (ветчина, бекон, колбасы). Охратоксин В встречается редко. Охратоксины также поражают все плоды садово-огородных культур. Особенно сильно поражаются яблоки: до 50% урожая может загрязняться микотоксинами.

Следует отметить, что охратоксины являются стабильными соединениями. Так, например, при длительном прогревании пшеницы, загрязненной охратоксином А, его содержание снижалось лишь на 32% (при температуре 250–300ºС). Таким образом, распространненость в продуктах питания, токсичность и устойчивость охратоксинов создают реальную опасность для здоровья человека.

Методы анализа

Охратоксин А содержится в окисленных продуктах. Он легко растворяется во многих органических растворителях, что используется для экстракции. Наиболее часто используется экстракция хлороформом и водным раствором фосфорной кислоты с последующей очисткой на колонке и количественное определение с использованием метода ТСХ.

Разработан также метод ВЭЖХ. Перед ВЭЖХ анализом образец готовят следующим образом. Измельченный образец обрабатывают смесью 2 М соляной кислоты и 0,4 М раствора хлорида магния. После гомогенизации экстрагируют толуолом в течение 60 мин. Смесь центрифугируют. Центрифугат пропускают через колонку с силикагелем и промывают смесью толуола с ацетоном (подвижная фаза). Охратоксин А элюируется смесью толуола с уксусной кислотой (9:1) и высушивается при 40°С. Остаток растворяют и фильтруют. Анализ проводят с использованием ВЭЖХ.

Кроме того, разработан ряд биопроб на креветках, бактериях, но полученные результаты не позволили использовать эти методы для определения охратоксинов.

ГУ НИИ питания РАМН, Москва

Охратоксин А - вторичный метаболит широко распространенных микроскопических плесневых грибов родов Penicillium (P. verrucosum) и Aspergillius (A. ochraceus) стоит в ряду приоритетных микотоксинов – контаминантов пищевых продуктов, и представляет реальную опасность для здоровья человека. Охратоксин А обладает выраженным нефротоксическим, канцерогененным, а также тератогененным, иммунотоксическим, нейротоксическим, генотоксическим и цитотоксическим действием . Международным агентством по исследованию рака (IARC) охратоксин А отнесен к веществам, возможно канцерогенным для человека (группа 2В) . При введении внутрь LD50 варьирует для разных видов животных от 20-30 мг/кг м. т. (для крыс) до 1 мг/кг м. т. (для свиней) . Охратоксин А рассматривается в качестве одного из этиологических факторов Балканской эндемической нефропатии - тяжелого почечного заболевания, регистрируемого в некоторых восточноевропейских странах (в частности Болгарии, Румынии, Сербии, Хорватии, Боснии и Герцеговине, Словении, Македонии) . Охратоксин А наиболее часто обнаруживается в зерновых продуктах, кофе, специях. В последнее время появляются данные о значительном загрязнении охратоксином А сухофруктов, вина и фруктовых соков. Так, в результате исследований, проведенных в странах ЕС, было установлено, что около 70% партий зерновых продуктов содержали охратоксин А в диапазоне от 0,00001 до 0,041 мг/кг, около 60% исследованных партий вина были загрязнены охратоксином А в количестве от 0,000003 до 0,016 мг/л . Особого внимания заслуживают данные о частом обнаружении охратоксина А в крови, а также материнском молоке населения многих европейских стран, что свидетельствует о постоянном поступлении этого микотоксина в организм человека . Основной вклад в величину поступления охратоксина А с продуктами питания вносят зерновые (44%), вино (10%) и кофе (9%) . Рекомендуемое Объединенным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам (JECFA) допустимое недельное потребление охратоксина А составляет 100 нг/кг/м. т. . Содержание охратоксина А в странах ЕС регламентируется на уровне 0,005 мг/кг в продовольственном сырье и 0,003 мг/кг в продуктах питания . Достоверные данные о загрязнении пищевых продуктов охратоксином А в РФ отсутствуют.

Разработанный ранее для нужд санитарно-эпидемиологической службы СССР метод определения охратоксина А в пищевых продуктах , использующий жидко-жидкостное распределение для очистки экстракта, имеет ряд недостатков: относительно низкая чувствительность метода (предел обнаружения - 0,001-0,002 мг/кг), значительная продолжительность анализа, а также необходимость использования большого количества хлорсодержащих органических растворителей.

К настоящему времени разработаны новые более эффективные методы определения охратоксина А в пищевых продуктах, основанные на применении твердофазной экстракции (ТФЭ) . Для ТФЭ характерна хорошая очистка экстракта, высокая степень извлечения и малый расход растворителей. При ТФЭ используют нормально-фазовую адсорбционную хроматографию на силикагеле , обращено - фазовую распределительную хроматографию на силикагеле, химически модифицированном октадецилсиланом , иммуноаффинную хроматографию , а также колоночную хроматографию на других сорбентах (диатомитовая земля (целит), полиамид, полимеры, полученные методом импринтинга и др.) .

Слабокислотные свойства (рКА = 4,4) охратоксина А (рис.1) определяют необходимость его экстракции либо в недиссоциированной форме смесями органических растворителей с кислотными водно-солевыми растворами , либо в виде соли - водными слабощелочными растворами, например, раствором гидрокарбоната натрия .

Обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) с флуориметрическим детектированием является наиболее широко распространенным методом определения охратоксина А в пищевых продуктах .

Целью исследования явилась разработка чувствительного метода обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах путем оптимизации аналитических подходов, основанных на использовании ТФЭ.

Экспериментальная часть

Аппаратура и реагенты. Хроматографическая система состояла из насоса высокого давления Jasco 880-PU, инжектора Rheodyne-7125 с объёмом петли-дозатора 20 мкл, флуориметрического детектора FL Detector model LC305 (Linear Instruments) (лвозб.=250 нм, лэмис.= 458 нм) и системы для сбора и обработки данных «Мультихром» (Амперсенд). Хроматографическая колонка (250 * 4,6 мм) с неподвижной фазой Kromasil C18 (MetaChem Technologies Inc.), с размером частиц 5 мкм.

Экстракцию проводили с использованием аппарата для встряхивания shaker s-3.08L (ELMI), для центрифугирования проб использовали центрифугу ЦЛС 31М. Твёрдофазную экстракцию проводили с использованием манифолда Macherey-Nagel, патронов ДИАПАК Силикагель (БиоХимМак СТ), иммуноаффинных колонок (ИАК) OCHRAPREP (R-BIOFARM RHONE LTD). рН растворов измеряли рН-метром МР 230 (Mettler Toledo). Концентрирование проб проводилось на роторном испарителя Laborota 4000 (Heidolph). Для растворения стандартов и упаренных экстрактов использовалась ультразвуковая ванна УЗВ-12л (ПКФ САПФИР). Для подбора оптимальных волн возбуждения и эмиссии использован флуоресцентный спектрофотометр Cary Eclipse (Varian). В качестве стандарта использовался стандартный образец охратоксина А в смеси бензол-уксусная кислота (99:1) с концентрацией С = 9,2 нг/мкл.

Твердофазная экстракция:

Очистка с помощью колоночной хроматографии (КХ) на диатомитовой земле. Экстракцию охратоксина А из 25,0 г. измельченной пробы проводили 125 мл хлороформа после добавления 20 мл 2% уксусной кислоты. Перемешивали на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. 50 мл пропущенного через бумажный фильтр хлороформного экстракта наносили на колонку с диатомитовой землей, импрегнированной гидрокарбонатом натрия. Колонку промывали последовательно 70 мл гексана и 30 мл хлороформа. Охратоксин А элюировали с колонки 150 мл смеси бензол – – уксусная кислота (86:12:2). Элюат упаривали досуха, растворяли в 3 мл подвижной фазы (ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (62:38) с использованием ультразвуковой ванны.

Очистка с помощью КХ на силикагеле. Экстракцию охратоксина А из 20,0 г. измельченной пробы проводили 100 мл толуола после последовательного добавления 30 мл 2М раствора соляной кислоты и 50 мл 0,4М раствора хлорида магния. Перемешивали 60 минут, центрифугировали со скоростью 3500 об./мин 5 минут. Верхний толуоловый слой фильтровали через бумажный фильтр, отбирая 50 мл фильтрата. После кондиционирования 10 мл толуола на патрон с силикагелем наносили 50 мл фильтрата, промывали дважды 10 мл н-гексана и 10 мл смеси толуол – ацетон (85:15), затем 5 мл толуола. Охратоксин А элюировали 40 мл смеси толуол – ацетон – уксусная кислота (89:10:1). Элюат упаривали досуха, растворяли в 1 мл подвижной фазы (ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (62:38) с использованием ультразвуковой ванны.

Очистка с помощью иммуноаффинной КХ . Экстракцию охратоксина А из 50,0г. измельченной пробы проводили 200 мл смеси ацетонитрил – вода (60:40). Перемешивали в течение 30 минут. 4 мл пропущенного через бумажный фильтр экстракта смешивали с 44 мл фосфатного и наносили на иммуноаффинную колонку (ИАК), которую затем промывали 20 мл фосфатного буфера. Остатки фосфатного буфера удаляли продуванием ИАК воздухом. Охратоксин А элюировали 3 мл смеси метанол – уксусная кислота (98:2). Элюат упаривали досуха, растворяли в 1 мл подвижной фазы (ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (62:38) с использованием ультразвуковой ванны.

Условия ВЭЖХ. Идентификацию и количественное определение охратоксина А проводили методом ОФ ВЭЖХ в режиме изократического элюирования с флуоресцентным детектированием (лвозб.=250 нм, лэмис.=458 нм). В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (62:38). Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. В систему для ВЭЖХ вводилось 20 мкл исследуемого раствора.

Результаты и их обсуждение.

При очистке экстракта путем КХ с диатомитовой землей, импрегнированной гидрокарбонатом натрия, в качестве базового был использован метод АОАС 975.38 , предусматривающий применение ТСХ для идентификации и количественного определения охратоксина А. Нами в целях повышения чувствительности и специфичности метода была использована ОФ ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием. В результате применения базового метода степень извлечения охратоксина А из матрикса, искусственно контаминированного охратоксином А на уровне 0,01 мг/кг, в наших условиях не превысила 40%. В целях повышения величины извлечения нами был внесен целый ряд изменений в условия экстракции и очистки: в состав экстрагирующей смеси была добавлена уксусная кислота; объем хлороформа, используемого для промывания колонки, уменьшен до 30 мл; в состав элюирующей смеси внесен ацетон; объем элюирующей смеси увеличен до 150 мл. В результате оптимизации метода величина извлечения охратоксина А из пшеницы возросла до 60% (табл.1).

Степень извлечения удалось существенно повысить, применив метод твердофазной экстракции на патронах с немодифицированным силикагелем (схема, приближенная к методу ICC № 000 ). Корректировка базового метода (увеличено содержание толуола в смеси толуол – ацетон, используемой для промывания колонки, до 85%, в состав элюирующей смеси внесен ацетон, объем элюирующей смеси доведен до 40 мл) позволила увеличить степень извлечения до 80%.

При использовании иммуноаффинной КХ наблюдалась максимальная степень извлечения охратоксина А из пищевого матрикса (до 100%), При этом предел обнаружения (0,0005 мг/кг) был выше, чем при очистке КХ на силикагеле (0,00005 мг/кг).

Для обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А с помощью ВЭЖХ был подобран оптимальный состав подвижной фазы (ПФ) и уточнены длины волн возбуждения и эмиссии флуоресценции, обеспечившие максимальный сигнал и селективность при детектировании охратоксина А (табл.2). Подобранная длина волн возбуждения (250 нм вместо 333 нм) и эмиссии флуоресценции для оптимизированной подвижной фазы позволила повысить отношение сигнал/шум с соответствующим снижением предела обнаружения метода. Изменение состава ПФ позволило улучшить разделение пиков охратоксина А и компонентов матрикса пищевого продукта при одновременном снижении времени удерживания пика охратоксина А (рис.2).

Возможность использования разработанного нами модифицированного метода, основанного на применении патронов с силикагелем, в рутинном анализе охратоксина А была подтверждена выборочным исследованием частоты и уровня загрязнения этим микотоксином основных видов продовольственного сырья. Для этого было изучено продовольственное зерно урожая 2004 года из различных регионов РФ (табл.3). Девять из 46 исследованных образцов зерна содержали охратоксин А в диапазоне от 0,00005 до 0,005 мг/кг, что не превышало регламенты, принятые в странах ЕС.

Таким образом, путем оптимизации существующих аналитических подходов предложены два варианта метода обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах: с использованием КХ на силикагеле или иммуноаффинной КХ для очистки экстрактов и оптимизированных условий ВЭЖХ. Метод, основанный на применении КХ на силикагеле, отличается низким пределом обнаружения и невысокой стоимостью расходных материалов. Очистка с помощью иммуноаффинной КХ обеспечивает высокую степень извлечения и чистоту экстракта, а также характеризуется более высоким пределом обнаружения (0,0005 мг/кг вместо 0,00005 мг/кг для варианта с очисткой КХ на силикагеле). Полученные в результате проведенного выборочного исследования содержания охратоксина А в продовольственном сырье данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения загрязнения охратоксином А продуктов питания в целях оценки риска контаминации этим микотоксином пищевых продуктов для здоровья населения РФ.

ГУ НИИ питания РАМН

109240, Москва, Устьинский проезд, д.2/14

I. V. Aksenov, K. I. Eller, V. A. Tutelyan

Optimization of analytical methods for ochratoxin A analysis in food.

Ochratoxin A is a mycotoxin produced by widely distributed Aspergillus and Penicillium species. The mycotoxin is a common contaminant of cereals, coffee, wine, dried fruits and spices. Ochratoxin A has been shown to be nephrotoxc, immunosuppressive, embryotoxic, teratogenic and carcinogenic in many mammalian species. Codex Alimentarius and EC have established maximum permissible level of 5 мg/kg for ochratoxin A in raw cereal grains and of 3 мg/kg – for ready-to-eat products derived from cereals. Two simple and reliable modifications of methods have been developed for the analysis of ochratoxin A in food which are based on immunoaffinity or silica gel column clean-up and HPLC with fluorescence detection. The detection limits were 0,5 мg/kg and 0,05 мg/kg respectively. Methods have been used successfully to analyze ochratoxin A in 46 samples of raw cereals harvested in different regions of Russia. Nine samples were found to be contaminated with ochratoxin A on levels ranged from 0,05 to 5 мg/kg.

Оптимизация аналитических методов обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах.

Охратоксин А – микотоксин, продуцируемый широко распространенными плесневыми грибами родов Aspergillius и Penicillium. Он является частым контаминантом зерновых продуктов, кофе, вина, сухофруктов и специи. Доказано нефротоксическое, иммуносупрессивное, эмбриотоксическое, тератогенное и канцерогенное действие охратоксина А для многих видов млекопитающих. Установленный Кодексом Алиментариус и ЕС максимальный допустимый уровень содержания охратоксина А в зерне равен 5 мкг/кг, в готовых к употреблению зерновых продуктах – 3 мкг/кг. Предложены два оптимизированыx метода обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах: с использованием КХ на силикагеле или иммуноаффинной КХ для очистки экстрактов и ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией. Предел обнаружения составил соответственно 0,05 и 0,5 мкг/кг. Разработанные методы использованы для анализа содержания охратоксина А в 46 образцах зерна, собранного в различных регионах России. Девять образцов были загрязнены охратоксином А в количестве от 0,05 до 5 мкг/кг.

Подписи к рисункам.

Рисунок 1. Химическая структура охратоксина А.

Рисунок 2. Хроматограммы образца пшеницы, контаминированного охратоксином А на уровне 0,01 мг/кг, при различных способах очистки:

А) КХ на диатомитовой земле Б) КХ на силикагеле В) иммуноаффинная КХ.

Таблица 1. Сравнительная характеристика различных способов очистки экстракта.

Таблица 2. Сравнительная характеристика параметров ВЭЖХ (для 1 нг охратоксина А во вколе).

	Состав ПФ	Длины волны флуориметрического детектированния, нм	Время удерживания охр. А, мин	Отношение сигнал/шум


ацетонитрил – вода – уксусная кислота (99:99:2)

ацетонитрил – вода – уксусная кислота (102:94:4)
Оптимизи-рованная методика
ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (124:76)

Таблица 3. Выборочное исследование уровня загрязнения охратоксином А продовольственного зерна урожая 2004 г.

Литература

Методические рекомендации по обнаружения, идентификации и определению содержания охратоксина А в пищевых продуктах. - М., 1985. , Кравченко (Медицинские и биологические аспекты) – М., 1985. AOAC, Determination of Ochratoxin A in Wine and Beer 2001.01 // J. AOAC Int. – 2001. - Vol. 84. - P. 1818. AOAC, Ochratoxin A in Corn and Barley 991.44 // J. AOAC Int. – 1996. - Vol. 79. – P. 1102-1105. AOAC, Ochratoxin A in Green Coffee 975.38 // J. AOAC Int. – 1975. - Vol. 58. - P. 258. Application note for analisis of ochratoxin A in cereal using sodium bicarbonate extracton in conjunction with Ochraprep. – Glasgow, 2001. Baggiani C., Giraudi G., Vanni A. // Bioseparation. - 2002. - Vol.10. – P. 389–mission Regulation (EC) № 000/2002 // Official Journal of the European Communities. - 2002. - L 75. - P. 18-20. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Vol. 56. – Lion, 1993. Jodlbauer J., Maier N. M., Lindner W. // Journal of Chromatography A. - 2002. - Vol. 945. – P. 45–63. Jornet D., Busto O., Guasch J // Journal of Chromatography A. - 2000. - Vol. 882. – P. 29–35. Krogh P. // Endemic nephropathy, Proceedings of the second International Symposium on Endemic nephropathy 9-12 November 1972. - Sofia, 1972. – P. 266-277. Kuhn I., Valenta H., Rohr K. // Journal of Chromatography B. - 1995. - Vol. 668. – P. 333–337. Majerus P., Weber R., Wolff J. // Bundesgesundheitsblatt. – 1994. – B. 37, N. 11. – S. 454 – 458. Monaci L., Palmisano F.// Anal. Bioanal. Chem. - 2004. - Vol. 378. - P. 96-103. Monaci L., Tantillo G., Palmisano F. // Anal. Bioanal. Chem. - 2004. - Vol. 378. – P. 1777–1782. Quantitative detection of Ochratoxin A.- Glasgow, 2003. Report of experts participating in Task 3.2.7 “Assessment of dietary intake of Ochratoxin A by the population of EU Member States”. – Rome, 2002. Safety evaluation of certain mycotoxins in food. // WHO Food Additives Series, No.47; FAO Food and Nutrition Paper 74. – Geneva, 2001. Schwartz G. G. // Cancer Causes Control. - 2002. - Vol.13. - P. 91-100. Scott P. M. // Adv. Exp. Med. Biol. - 2002. - Vol. 504. – P. 117-134. Skaug MA, Helland I, Solvoll K, Saugstad O. D. // Food Addit. Contam. - 2001. - Vol. 18. – P. 321-327. Visconti A., Pascale M., Centonze G. // Journal of Chromatography A. - 1999. - Vol. 864. – P. 89–101. Zimmerli B., Dick R. // Journal of Chromatography B. – 1995. - Vol. 666. – P. 85 – 99.

Концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг

Границы относительной погрешности (показатель точности) (±d), %, Р = 0,95

Стандартное отклонение повторяемости (sr ), %

Предел повторяемости (r ), %

Полнота извлечения веществ, %

4.2 . Вспомогательное оборудование


Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С или аналогичный
Ротационный испаритель ИР-1М с ловушкой или аналогичный
Электрошкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры ±2,5 в интервале от 50 до 350 °С
Холодильник бытовой
Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3А или аналогичная рН-метр	ТУ 46-22-236-79
Магнитная мешалка типа ММ 5 с перемешивающим стержнем	ТУ 25-11.834-80
Колбы плоскодонные конические на 250 см3 с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32	ГОСТ 10394-74
Флаконы стеклянные завинчивающиеся из темного стекла (вайл), объемом 7 см3
Колбы мерные, вместимостью 100, 500, 1000 см3 тип 2-100-2,2-500-2
Воронки лабораторные
Колбы грушевидные на 10 см3 с НШ 14,5, тип ГрКШ-10-14/23	ГОСТ 10394-72

4.3 . Реактивы и материалы

. Подготовка к выполнению измерений

5.1 . Приготовление стандартных растворов охратоксина А

Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина А - 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина А массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см3, приливают 50 см3 смеси толуол-уксусная кислота (98:2 % об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм (Д333). Концентрацию раствора вычисляют по формуле:

5.2 . Приготовление фосфатного буферного раствора, рН = 7,4

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 10 - 20 см3 дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.

5.3 . Приготовление смесей растворителей

Толуол -уксусная кислота (98:2 % об .).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил -вода (60:40 % об .).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил -вода (60:40 % об .; рН = 3 ,0 ).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят рН смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Метанол -уксусная кислота (98:2 % об .).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

. Отбор и подготовка проб для анализа

6.1 . Отбор проб

«Зерно. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 13586.3-83 ;

«Крупа. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 26312.1-84 ;

«Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб» ГОСТ 27668-88 ;

«Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию» ГОСТ 8756.0-70 .

6.2 . Подготовка проб для анализа

6.2.1 . Экстракция

Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см, добавляют 100 см3 смеси ацетонитрил-вода (60:40 % об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента». Отбирают 10 см3 фильтрата и добавляют 90 см фосфатного буферного раствора, рН = 7,4.

6.2.2 . Очистка экстракта

На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, промывают 20 см3 фосфатного буферного раствора, рН = 7,4. Охратоксин А элюируют 3 см3 смеси метанол-уксусная кислота (98: 2 % об.).

. Выполнение измерений

7.1 . Приготовление тестового образца

Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).

7.2 . Условия хроматографирования

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - ацетонитрил-вода (60:40 % об.; рН = 3,0); скорость подвижной фазы - 1,5 см3/мин.

. Обработка результатов измерения

8.1 . Построение градуированной зависимости

Результат анализа представляют в виде (при вероятности Р = 0,95):

D - граница абсолютной погрешности:

d - граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл. 1).

* 0,0001 мг/кг - предел обнаружения.

. Требования к квалификации исполнителя

К выполнению анализа охратоксина А в зерне и зернопродуктах допускаются лица со специальным высшим образованием или средним специальным образованием, владеющие техникой ВЭЖХ-анализа, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие опыт работы в химической лаборатории.