Метод на флуоресцентна in situ хибридизация за риби. Флуоресцентна in situ хибридизация (FISH)

Ръководител на
"онкогенетика"

Жусина
Юлия Генадиевна

Завършил педиатричния факултет на Воронежския щат медицински университеттях. Н.Н. Бурденко през 2014 г.

2015 г. - стаж по терапия в катедрата по факултетна терапия на VSMU. Н.Н. Бурденко.

2015 - сертификационен курспо специалността "Хематология" на базата на Центъра за хематологични изследвания в Москва.

2015-2016 г. – терапевт във ВГКБСМП №1.

2016 г. - темата на дисертацията за конкурса е одобрена научна степенкандидат на медицинските науки „изучаване на клиничния ход на заболяването и прогнозата при пациенти с хронична обструктивна белодробна болест с анемичен синдром“. Съавтор на повече от 10 публикувани труда. Участник в научно-практически конференции по генетика и онкология.

2017 г. - курс за напреднали на тема: „интерпретация на резултатите от генетични изследвания при пациенти с наследствени заболявания“.

От 2017 г. пребиваване по специалността „Генетика“ на базата на RMANPO.

Ръководител на
"генетика"

Канивец
Иля Вячеславович

Канивец Иля Вячеславович, генетик, кандидат на медицинските науки, ръководител на генетичния отдел на медицинския генетичен център Genomed. Катедра асистент медицинска генетикаРуски медицинска академиянепрекъснато професионално обучение.

Завършва Медицинския факултет на Московския държавен медико-стоматологичен университет през 2009 г., а през 2011 г. - ординатура по специалността "Генетика" в катедрата по медицинска генетика на същия университет. През 2017 г. защитава дисертация за научна степен "Кандидат на медицинските науки" на тема: Молекулярна диагностика на вариациите на броя на копията на ДНК участъци (CNVs) при деца с вродени малформации, фенотипни аномалии и/или умствена изостаналостпри използване на SNP олигонуклеотидни микрочипове с висока плътност"

От 2011-2017 г. работи като генетик в Детската клинична болница на името на. Н.Ф. Филатов, научно-консултативен отдел на Федералната държавна бюджетна институция „Център за медико-генетични изследвания“. От 2014 г. до момента е началник на отделението по генетика на МЦ Геномед.

Основни области на дейност: диагностика и лечение на пациенти с наследствени заболявания и вродени малформации, епилепсия, медицинско и генетично консултиране на семейства, в които е родено дете с наследствена патология или дефекти в развитието, пренатална диагностика. По време на консултацията се анализират клинични данни и генеалогия, за да се определи клиничната хипотеза и необходимото количество генетични изследвания. Въз основа на резултатите от проучването данните се интерпретират и получената информация се разяснява на консултантите.

Той е един от създателите на проекта „Училище по генетика”. Редовно изнася презентации на конференции. Изнася лекции пред генетици, невролози и акушер-гинеколози, както и пред родители на пациенти с наследствени заболявания. Автор и съавтор е на повече от 20 статии и рецензии в руски и чуждестранни списания.

Област на професионални интереси е прилагането на съвременни геномни изследвания в клиничната практика и интерпретацията на резултатите от тях.

Приемно време: сряда, петък 16-19ч

Ръководител на
"неврология"

Шарков
Артьом Алексеевич

Шарков Артьом Алексеевич– невролог, епилептолог

През 2012 г. учи международна програма„Източна медицина“ в университета Daegu Haanu в Южна Корея.

От 2012 г. - участие в организацията на база данни и алгоритъм за интерпретиране на генетични тестове xGenCloud (https://www.xgencloud.com/, ръководител на проекта - Игор Угаров)

През 2013 г. завършва педиатричния факултет на Руския национален изследователски медицински университет на името на N.I. Пирогов.

От 2013 г. до 2015 г. учи в клинична ординатура по неврология във Федералната държавна бюджетна институция "Научен център по неврология".

От 2015 г. работи като невролог и изследовател в Научноизследователския клиничен институт по педиатрия на името на академик Ю.Е. Велтищев ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогов. Той също така работи като невролог и лекар в лабораторията за видео-ЕЕГ мониторинг в клиниките на Центъра по епилептология и неврология на името на. А.А.Казарян“ и „Епилептичен център“.

През 2015 г. преминава обучение в Италия в училището “2nd International Residential Course on Drug Resistant Epilepsies, ILAE, 2015”.

През 2015 г. усъвършенствано обучение - „Клинична и молекулярна генетика за практикуващи лекари“, RDKB, RUSNANO.

През 2016 г. усъвършенствано обучение - „Основи на молекулярната генетика“ под ръководството на биоинформатик, д-р. Коновалова F.A.

От 2016 г. - ръководител на неврологично направление на лаборатория Genomed.

През 2016 г. завършва обучение в Италия в училището “San Servolo international advanced course: Brain Exploration and Epilepsy Surger, ILAE, 2016”.

През 2016 г. усъвършенствано обучение - „Иновативни генетични технологии за лекари“, „Институт по лабораторна медицина“.

През 2017 г. – школа „NGS по медицинска генетика 2017“, Московски държавен изследователски център

В момента се провежда Научно изследванев областта на генетиката на епилепсията под ръководството на проф. д.м.н. Белоусова Е.Д. и професор, доктор на медицинските науки. Дадали Е.Л.

Утвърдена е темата на дисертацията за научната степен „Кандидат на медицинските науки“ „Клинични и генетични характеристики на моногенни варианти на ранни епилептични енцефалопатии“.

Основните направления на дейност са диагностика и лечение на епилепсия при деца и възрастни. Тясна специализация – хирургично лечение на епилепсия, генетика на епилепсията. Неврогенетика.

Научни публикации

Шарков А., Шаркова И., Головтеев А., Угаров И. „Оптимизиране на диференциалната диагноза и интерпретация на резултатите от генетични изследвания с помощта на експертната система XGenCloud за някои форми на епилепсия.“ Медицинска генетика, № 4, 2015, с. 41.
*
Шарков А.А., Воробьов А.Н., Троицки А.А., Савкина И.С., Дорофеева М.Ю., Меликян А.Г., Головтеев А.Л. „Епилептична хирургия при мултифокални мозъчни лезии при деца с туберозна склероза.“ Резюмета на XIV руски конгрес "ИНОВАЦИОННИ ТЕХНОЛОГИИ В ПЕДИАТРИЯТА И ДЕТСКАТА ХИРУРГИЯ." Руски бюлетин по перинатология и педиатрия, 4, 2015. - p.226-227.
*
Дадали Е.Л., Белоусова Е.Д., Шарков А.А. „Молекулярно-генетични подходи за диагностика на моногенни идиопатични и симптоматични епилепсии.“ Тезис на XIV руски конгрес "ИНОВАЦИОННИ ТЕХНОЛОГИИ В ПЕДИАТРИЯТА И ДЕТСКАТА ХИРУРГИЯ." Руски бюлетин по перинатология и педиатрия, 4, 2015. - стр.221.
*
Шарков А.А., Дадали Е.Л., Шаркова И.В. „Рядък вариант на ранна епилептична енцефалопатия тип 2, причинена от мутации в гена CDKL5 при пациент от мъжки пол.“ Конференция "Епилептологията в системата на невронауките". Сборник материали от конференцията: / Ред.: проф. Незнанова Н.Г., проф. Михайлова В.А. Санкт Петербург: 2015. – с. 210-212.
*
Дадали Е.Л., Шарков А.А., Канивец И.В., Гундорова П., Фоминых В.В., Шаркова И.В. Троицки А.А., Головтеев А.Л., Поляков А.В. Нов алелен вариант на миоклонус епилепсия тип 3, причинен от мутации в гена KCTD7 // Медицинска генетика.-2015.- Том 14.-№9.- стр.44-47
*
Дадали Е.Л., Шаркова И.В., Шарков А.А., Акимова И.А. „Клинични и генетични особености и съвременни методи за диагностициране на наследствени епилепсии.“ Сборник с материали „Молекулярно-биологични технологии в медицинската практика” / Изд. чл.-кор ДЪЖД А.Б. Масленникова.- Бр. 24.- Новосибирск: Академиздат, 2016.- 262: с. 52-63
*
Белоусова Е.Д., Дорофеева М.Ю., Шарков А.А. Епилепсия при туберозна склероза. В „Мозъчни заболявания, медицински и социални аспекти"под редакцията на Гусев Е.И., Гехт А.Б., Москва; 2016; стр.391-399
*
Дадали Е.Л., Шарков А.А., Шаркова И.В., Канивец И.В., Коновалов Ф.А., Акимова И.А. Наследствени заболявания и синдроми, придружени от фебрилни гърчове: клинични и генетични характеристики и диагностични методи. //Руски журнал за детска неврология.- Т. 11.- № 2, стр. 33- 41. doi: 10.17650/ 2073-8803-2016-11-2-33-41
*
Шарков А.А., Коновалов Ф.А., Шаркова И.В., Белоусова Е.Д., Дадали Е.Л. Молекулярно-генетични подходи за диагностика на епилептичните енцефалопатии. Сборник резюмета „VI БАЛТИЙСКИ КОНГРЕС ПО ДЕТСКА НЕВРОЛОГИЯ” / Под редакцията на проф. Гузева V.I. Санкт Петербург, 2016, с. 391
*
Хемисферотомия за лекарствено-резистентна епилепсия при деца с двустранно увреждане на мозъка Зубкова Н.С., Алтунина Г.Е., Землянски М.Ю., Троицки А.А., Шарков А.А., Головтеев А.Л. Сборник резюмета „VI БАЛТИЙСКИ КОНГРЕС ПО ДЕТСКА НЕВРОЛОГИЯ” / Под редакцията на проф. Гузева V.I. Санкт Петербург, 2016, с. 157.
*
*
Статия: Генетика и диференцирано лечение на ранните епилептични енцефалопатии. А.А. Шарков*, И.В. Шаркова, Е.Д. Белоусова, Е.Л. Да, те го направиха. Вестник по неврология и психиатрия, 9, 2016; Vol. 2doi: 10.17116/jnevro 20161169267-73
*
Головтеев А.Л., Шарков А.А., Троицки А.А., Алтунина Г.Е., Землянски М.Ю., Копачев Д.Н., Дорофеева М.Ю. "Хирургично лечение на епилепсия при туберозна склероза" под редакцията на Дорофеева М.Ю., Москва; 2017 г.; стр.274
*
Нови международни класификации на епилепсиите и епилептичните припадъци на Международната лига за борба с епилепсията. Вестник по неврология и психиатрия. C.C. Корсаков. 2017. Т. 117. № 7. С. 99-106

Ръководител на
"Пренатална диагностика"

Киев
Юлия Кириловна

През 2011 г. завършва Московския държавен медицински и стоматологичен университет. ИИ Евдокимова със специалност „Обща медицина” Специалност „Генетика” в катедра „Медицинска генетика” на същия университет.

През 2015 г. е преминала стаж по акушерство и гинекология в Медицинския институт за повишаване на квалификацията на лекарите на Федералната държавна бюджетна образователна институция за висше професионално образование "MSUPP"

От 2013 г. провежда консултации в ДБУ „Център за семейно планиране и репродукция” към Министерството на здравеопазването.

От 2017 г. е ръководител на направление „Пренатална диагностика” на лаборатория Genomed.

Редовно прави презентации на конференции и семинари. Изнася лекции пред различни лекари специалисти в областта на репродукцията и пренаталната диагностика

Осигурява медицинско и генетично консултиране на бременни жени за пренатална диагностика с цел предотвратяване на раждането на деца с вродени малформации, както и семейства с предполагаема наследствена или вродена патология. Интерпретира получените резултати от ДНК диагностика.

СПЕЦИАЛИСТИ

Латипов
Артър Шамилевич

Латипов Артур Шамилевич е лекар генетик от най-висока квалификационна категория.

След като завършва Казанския държавен медицински факултет през 1976 г медицински институтдълги години работи първо като лекар в кабинета по медицинска генетика, след това като ръководител на медико-генетичния център на Републиканската болница на Татарстан, главен специалист на Министерството на здравеопазването на Република Татарстан и като учител в катедрите на Казанския медицински университет.

Автор над 20 научни трудовепо проблемите на репродуктивната и биохимичната генетика, участник в много местни и международни конгреси и конференции по проблемите на медицинската генетика. Внедрена в практическа работаЦентър за методи за масов скрининг на бременни и новородени за наследствени заболявания, извършил хиляди инвазивни процедури при съмнения за наследствени заболявания на плода в различни срокове на бременността.

От 2012 г. работи в Катедрата по медицинска генетика с курс по пренатална диагностика Руска академияследдипломно обучение.

Област на научни интереси: метаболитни заболявания при деца, пренатална диагностика.

Приемно време: сряда 12-15, събота 10-14

Лекарите се преглеждат с уговорка.

Генетик

Габелко
Денис Игоревич

През 2009 г. завършва Медицинския факултет на KSMU на име. С. В. Курашова (специалност „Обща медицина”).

Стаж в Санкт Петербургската медицинска академия за следдипломно образование на Федералната агенция по здравеопазване и социално развитие(специалност "Генетика").

Стаж по терапия. Първична преквалификация по специалност „Ултразвукова диагностика”. От 2016 г. е служител в отдела на катедрата основиКлиничен медицински институт по фундаментална медицина и биология.

Област на професионални интереси: пренатална диагностика, използване на съвременни скринингови и диагностични методи за идентифициране на генетична патология на плода. Определяне на риска от повторна поява на наследствени заболявания в семейството.

Участник в научно-практически конференции по генетика и акушерство и гинекология.

Трудов стаж 5 години.

Консултация с предварително записване

Лекарите се преглеждат с уговорка.

Генетик

Гришина
Кристина Александровна

Завършила е Московския държавен медицински и стоматологичен университет през 2015 г. със специалност „Обща медицина“. През същата година тя влезе в резидентура по специалността 08/30/30 „Генетика“ във Федералната държавна бюджетна институция „Център за медицински генетични изследвания“.
Назначена е в Лабораторията по молекулярна генетика на комплексно наследствените заболявания (ръководител д-р А.В. Карпухин) през март 2015 г. като научен сътрудник. От септември 2015 г. е преместена на длъжност научен сътрудник. Той е автор и съавтор на повече от 10 статии и резюмета по клинична генетика, онкогенетика и молекулярна онкология в руски и чуждестранни списания. Редовен участник в конференции по медицинска генетика.

Област на научни и практически интереси: медицинско и генетично консултиране на пациенти с наследствена синдромна и мултифакторна патология.

Консултацията с генетик ви позволява да отговорите на следните въпроси:

Симптомите на детето признаци ли са за наследствено заболяване? какви изследвания са необходими за установяване на причината определяне на точна прогноза препоръки за провеждане и оценка на резултатите от пренаталната диагностика всичко, което трябва да знаете, когато планирате семейство консултация при планиране на IVF консултации на място и онлайн

взе участие в научно-практическата школа „Иновативни генетични технологии за лекари: приложение в клиничната практика“, конференцията на Европейското дружество по човешка генетика (ESHG) и други конференции, посветени на човешката генетика.

Провежда медицинско и генетично консултиране на семейства със съмнение за наследствени или вродени патологии, включително моногенни заболявания и хромозомни аномалии, определя индикации за лабораторни генетични изследвания и интерпретира резултатите от ДНК диагностиката. Консултира бременни жени за пренатална диагностика за предотвратяване на раждането на деца с вродени малформации.

Генетик, акушер-гинеколог, кандидат на медицинските науки

Кудрявцева
Елена Владимировна

Генетик, акушер-гинеколог, кандидат на медицинските науки.

Специалист в областта на репродуктивното консултиране и наследствената патология.

Завършва Уралската държавна медицинска академия през 2005 г.

Специализация по акушерство и гинекология

Стаж по специалност "Генетика"

Професионална преквалификация по специалност „Ултразвукова диагностика”

Дейности:

Безплодие и спонтанен аборт

Завършила е Медицинския факултет на Нижегородската държавна медицинска академия (специалност „Обща медицина”). Завършила е клинична ординатура във ФБНУ "МГНЦ" със специалност "Генетика". През 2014 г. преминава стаж в Клиника за майчинство и детство (IRCCS materno infantile Burlo Garofolo, Триест, Италия).

От 2016 г. работи като лекар-консултант в Genomed LLC.

Редовно участва в научно-практически конференцииот генетиката.

Основни дейности: Консултации по клинична и лабораторна диагностика на генетични заболявания и интерпретация на резултатите. Лечение на пациенти и техните семейства със съмнение за наследствена патология. Консултиране при планиране на бременност, както и по време на бременност, за пренатална диагностика с цел предотвратяване на раждането на деца с вродени патологии.

Кратко описание

Флуоресцентната in situ хибридизация е комбинация от цитогенетични и молекулярно-генетични техники. Принципът на метода FISH е хибридизация - свързването на ДНК сонда с хромозомната ДНК на изследваната проба от пациента. Сондата е малко парче ДНК, белязано с флуоресцентно багрило, което се свързва със специфична област на хромозомата. След това пробите се изследват с помощта на флуоресцентна микроскопия, като се използват подходящи филтри за сондите. FISH може да идентифицира цели хромозоми, специфични за хромозоми региони или уникални последователности с едно копие, в зависимост от използваните техники за етикетиране.

Прикачени файлове: 1 файл

Характеристика на метода FISH, която фундаментално го отличава от класическия цитогенетичен анализ, е, че този метод е приложим както за метафазни, така и за интерфазни ядра, което значително опростява работата и намалява времето, прекарано в изследване.Днес има широк спектър от ДНК - сонди за всички хромозоми, както и за техните отделни региони, центромери и дори гени. Технологията FISH ви позволява да определите броя на хромозомните копия във всеки сперматозоид (изследване на анеуплоидия).В допълнение към аномалиите на кариотипа, най-честата генетична причина за безплодие при мъжете е нарушение на сперматогенезата. Сперматогенезата е сложен многоетапен процес, който се контролира голяма сумагени, разположени както на автозоми, така и на гонозоми (полови хромозоми), особено на Y хромозомата. По този начин микроделеции на AZF локуса на Y хромозомата се откриват средно в 10-15% от случаите на азооспермия и в 5-10% от случаите на тежка олигозооспермия и причиняват нарушения на сперматогенезата и безплодие при мъжете.

Принцип на метода FISH

Методът FISH се основава на реакция на хибридизация между изкуствено създадена ДНК сонда и комплементарна нуклеотидна последователност на ядрена ДНК. Молекулата на ДНК се състои от две спирално свързани нуклеотидни вериги и хибридизацията е възможна само ако веригите се раздалечат. За да се разделят нуклеотидните вериги на ДНК, те прибягват до денатурация (за последваща хибридизация, както ДНК в ядрата на тестовата проба, така и самата ДНК сонда трябва да бъдат денатурирани). След денатуриране, ДНК сондата се хибридизира към своята комплементарна нуклеотидна последователност и може да бъде открита с помощта на флуоресцентен микроскоп.

По този начин, обща формаПротоколът за поставяне на FISH може да бъде представен, както следва:

1. Приготвяне на хистологичен или цитологичен препарат.

Подготовката на хистологичния препарат се извършва по стандартната процедура: изрязване, маркиране, окабеляване, запълване, микротомия, поставяне на среза върху предметно стъкло и депарафинизация. При приготвянето на цитологичен препарат се използват специални утаителни разтвори и центрофугиране, което позволява да се получи концентрирана клетъчна суспензия.

2. Предварителна обработка (при необходимост).

Лекарството се третира с протеази, за да се елиминира наличието на протеини, които възпрепятстват хибридизацията.

3. Прилагане на ДНК сонда към препарата и последваща денатурация.

За да се денатурират сондата и пробата ДНК, те се третират с формамид и се нагряват до температура около 85-90°C.

4. Хибридизация.

След денатуриране лекарството се охлажда до определена температура (37°C в случай на клинични изследвания) и се инкубира във влажна камера за няколко часа (продължителността на инкубацията е посочена във всеки конкретен протокол). Понастоящем се използват автоматични хибридизатори за денатурация и хибридизация.

5. Измиване.

След завършване на хибридизацията е необходимо да се отмият несвързаните проби, които иначе биха създали фон, който би затруднил оценката на резултатите от FISH анализа. Обикновено за изплакване се използва разтвор, съдържащ натриев цитрат и хлорид (SSC).

6. Контраоцветяване.

Използвайки флуоресцентни багрила (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; пропидиев йодид), цялата ядрена ДНК се оцветява.

7. Анализ на резултатите с помощта на флуоресцентен микроскоп.

ДНК сонди

Флуоресцентната in situ хибридизация използва ДНК сонди (ДНК сонди), които се свързват с комплементарни цели в пробата. ДНК сондите съдържат нуклеозиди, белязани с флуорофори (директно маркиране) или конюгати като биотин или дигоксигенин (индиректно маркиране). При директно маркиране, ДНК сондата, свързана с мишената, може да се наблюдава с помощта на флуоресцентен микроскоп веднага след завършване на хибридизацията. В случай на индиректно маркиране е необходима допълнителна процедура на оцветяване, по време на която биотинът се открива с помощта на флуоресцентно белязан авидин или стептавидин, а дигоксигенинът се открива с помощта на флуоресцентно белязани антитела. Въпреки че косвеното маркиране на ДНК сонди изисква допълнителни реагенти и време, този метод обикновено позволява повече високо нивосигнал поради наличието на 3-4 флуорохромни молекули върху антитялото или молекулата на авидин. Освен това, в случай на индиректно маркиране, е възможно каскадно усилване на сигнала.

FISH може да се използва за различни цели с помощта на три различни вида сонди:

Локус-специфични сонди, които се свързват със специфични области на хромозомите. Тези проби се използват за идентифициране на съществуващата къса последователност от изолирана ДНК, която се използва за приготвяне на белязана сонда и нейната последваща хибридизация с набор от хромозоми,

Алфоидните или центромерните повтарящи се проби са повтарящи се последователности на центромерните области на хромозомите. С тяхна помощ всяка хромозома може да бъде боядисана в различен цвят, което ви позволява бързо да определите броя на хромозомите и отклоненията от нормалния им брой,

Хромозомните сонди са набор от малки сонди, които са комплементарни на отделните региони на хромозомата, но като цяло покриват цялата й дължина. Използвайки библиотека от такива сонди, е възможно да се „оцвети“ цялата хромозома и да се получи диференциален спектрален кариотип на индивид. Този тип анализ се използва за анализиране на хромозомни аберации, като транслокации, когато част от една хромозома се прехвърля в рамото на друга.

Материали за изследване

Материалът за изследването е кръв, костен мозък, туморна биопсия, плацента, фетална тъкан или амниотична течност. Пробите за изследване трябва да се доставят в лабораторията свежи. Предметните стъкла се приготвят директно от тъканни проби или след тяхното култивиране. Могат да се използват както метафазни, така и интерфазни клетъчни препарати. Специфични ДНК сонди, белязани с флуоресцентни етикети, хибридизират с хромозомна ДНК и множество сонди за различни локуси могат да се използват едновременно.

FISH е полезен и чувствителен метод за цитогенетичен анализ за откриване на количествени и качествени хромозомни аберации, като делеции (включително микроделеции), транслокации, дупликации и анеуплоидия. FISH върху интерфазни хромозоми е бърз метод за пренатална диагностика на тризомии 21, 18 или 13 или аберации на половите хромозоми. В онкологията FISH може да открие редица транслокации (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), свързани с хематологични злокачествени заболявания. Методът може да се използва и за наблюдение на остатъчен рак след химиотерапия и трансплантация на костен мозък и идентифициране на усилени онкогени (c-myc/n-myc), свързани с лоша прогноза за някои тумори. FISH се използва и за наблюдение на оцеляването на алографт на костен мозък, получен от индивид от противоположния пол.

FISH е чувствителен метод за идентифициране на хромозомни аберации и бърз анализ на голям (>500) брой клетки наведнъж. Методът е много точен при идентифициране на природата на хромозомите и неизвестни фрагменти от хромозомна ДНК. Въпреки това, флуоресцентната in situ хибридизация има един значителен недостатък. Сондите са специфични само за една област на генома и в резултат на това в едно изследване е възможно да се определи наличието или броя на копията само на тази област (или няколко, когато се използват многоцветни сонди). Следователно правилната клинична обстановка е важна и FISH анализът може само да потвърди или не диагнозата. В последния случай анализът трябва да се повтори по отношение на подобни синдроми и това не винаги води до желания резултат. Алтернатива на този метод е анализът на хромозомни микрочипове, който със същата точност, чувствителност и специфичност определя количеството генетичен материал в стотици хиляди (и дори милиони) точки в генома, което прави възможно диагностицирането на почти всички известни синдроми на микроделеция и микродупликация.

За създаване на ДНК сонди се използват клонирани ДНК последователности, геномна ДНК, PCR реакционни продукти, маркирани олигонуклеотиди и ДНК, получена чрез микродисекция.. Маркирането на сондата може да се извърши по различни начини, например чрез ник транслация или използване на PCR с маркирани нуклеотиди.

Процедура на хибридизация

Първият етап включва изграждането на сонди. Размерът на сондата трябва да бъде достатъчно голям, за да се осъществи хибридизация на определено място, но не прекалено голям (не повече от 1 000 bp), за да не пречи на процеса на хибридизация. При идентифициране на специфични локуси или при оцветяване на цели хромозоми е необходимо да се блокира хибридизацията на ДНК проби с неуникални повтарящи се ДНК последователности чрез добавяне на небелязани ДНК повторения към хибридизационната смес (например Cot-1 ДНК). Ако ДНК сондата е двуверижна ДНК, тогава тя трябва да бъде денатурирана преди хибридизация.На следващия етап се приготвят препарати от интерфазни ядра или метафазни хромозоми. Клетките се фиксират върху субстрат, обикновено върху предметно стъкло, и след това ДНК се денатурира. За да се запази морфологията на хромозомите или ядрата, денатурацията се извършва в присъствието на формамид, което позволява температурата на денатурация да се намали до 70 ° След това към препарата се добавят сонди и се извършва хибридизация за около 12 часа. След това се извършват няколко стъпки на промиване, за да се отстранят всички нехибридизирани сонди.

Визуализацията на свързаните ДНК проби се извършва с помощта на флуоресцентен микроскоп. Интензитетът на флуоресцентния сигнал зависи от много фактори - ефективността на маркиране със сондата, вида на сондата и вида на флуоресцентното багрило Промени в генотипа на родителите, водещи до нарушена репродукция и невъзможност за зачеване на дете по естествен път , могат да бъдат предадени на бъдещо потомство, когато се използват асистирани репродуктивни технологии. Този факт показва необходимостта от предимплантационна генетична диагностика на семейни двойки преди провеждане на ART програма за предотвратяване на раждането на болно дете.

Методът FISH може да се използва на всеки клиничен/изследователски микроскоп, който има възможност за флуоресцентно изобразяване, като Olympus, Zeiss и др.

Въпреки че изображенията могат да бъдат получени и анализирани ръчно, софтуерът за анализ на изображения също често се използва в комбинация с автоматизирана микроскопия за повишаване на ефективността и точността.Автоматизирането на метода FISH и разработването на иновативни технологии като сравнителна геномна хибридизация са важно развитие на репродуктивната и перинаталната медицина и водят до подобряване на качеството и ефективността на диагностиката.

Уреди и реактиви за FISH анализ

FISH диагностичните методи са широко използвани за изследване на хромозомни аномалии в интерфазните ядра, което е особено важно от практическа гледна точка, тъй като методът е икономичен и отнема малко време. Обикновено, ако например пациент или плод има дисомия на хромозома 21, две флуоресцентни цветни точки ще бъдат видими към ядрото. Ако имате тризомия 21 (синдром на Даун), ще се виждат три точки.

Методите на молекулярната цитогенетика са подобрили проверката на хромозомните заболявания. При използване на конвенционални цитогенетични тестове делът на неоткритите случаи е 10%, а при използване на технологията FISH той намалява до 0,9-1,5%. Изследванията на хромозомните синдроми се основават на използването на различни видове ДНК сонди, които позволяват маркиране (етикетиране) на отделни хромозоми или техни участъци. За успешно практическо използване на тези методи са създадени специални библиотеки от специфични за хромозомите ДНК участъци. ДНК сонди в последните годинимаркирани с различни цветове (цветни FISH технологии), което позволява не само да се подобри качеството на анализа и да се анализират количествените и структурни пренареждания на хромозомите, но и да се извърши експресна диагностика, което е особено важно за пренаталната диагностика.

Флуоресцентна in situ хибридизация

Флуоресцентна хибридизация на място , или FISH метод (англ. Флуоресценция на място хибридизация - РИБИ ) - цитогенетичен метод, който се използва за откриване и определяне на позицията на специфична ДНК последователност върху метафазни хромозоми или в интерфазни ядра на място. Освен това FISH се използва за откриване на специфични иРНК в тъканна проба. В последния случай методът FISH дава възможност да се установят пространствено-времевите характеристики на генната експресия в клетките и тъканите.

сонди

С флуоресцентна хибридизация на мястоизползвайте ДНК сонди (ДНК сонди), които се свързват с комплементарни цели в пробата. ДНК сондите съдържат нуклеозиди, белязани с флуорофори (директно маркиране) или конюгати като биотин или дигоксигенин (индиректно маркиране). При директно маркиране, ДНК сондата, свързана с мишената, може да се наблюдава с помощта на флуоресцентен микроскоп веднага след завършване на хибридизацията. В случай на индиректно маркиране е необходима допълнителна процедура на оцветяване, по време на която биотинът се открива с помощта на флуоресцентно белязан авидин или стептавидин, а дигоксигенинът се открива с помощта на флуоресцентно белязани антитела. Въпреки че индиректната версия на маркиране с ДНК сонда изисква допълнителни реагенти и време, този метод обикновено позволява да се постигне по-високо ниво на сигнала поради наличието на 3-4 флуорохромни молекули върху антитялото или молекулата на авидин. Освен това, в случай на индиректно маркиране, е възможно каскадно усилване на сигнала.

За създаване на ДНК проби се използват клонирани ДНК последователности, геномна ДНК, продукти от PCR реакция, белязани олигонуклеотиди и ДНК, получена чрез микродисекция.

Може да се направи етикетиране на сондата различни начини, например чрез ник транслация или използване на PCR с белязани нуклеотиди.

Процедура на хибридизация

Схема на експеримента за флуоресцентна хибридизация на мястоза локализиране на позицията на ген в ядрото

На следващия етап се приготвят препарати от интерфазни ядра или метафазни хромозоми. Клетките се фиксират върху субстрат, обикновено върху предметно стъкло, и след това ДНК се денатурира. За да се запази морфологията на хромозомите или ядрата, денатурацията се извършва в присъствието на формамид, което позволява температурата на денатурация да се намали до 70 °.

Литература

Рубцов Н.Б. Методи за работа с хромозоми на бозайници: Учебник. надбавка / Новосибирск. състояние унив. Новосибирск, 2006. 152 с.

Рубцов Н.Б. Хибридизация нуклеинова киселина на мястопри анализ на хромозомни аномалии. Глава в книгата „Въведение в молекулярната диагностика” том 2. „Молекулярно-генетични методи в диагностиката на наследствени и онкологични заболявания” / Изд. М.А. Палцева, Д.В. Залетаева. Учебна литератураза студенти медицински университети. М.: Медицина, 2011. Т. 2. С. 100–136.

Бележки

Фондация Уикимедия. 2010 г.

Вижте какво е „флуоресцентна in situ хибридизация“ в други речници:

Този термин има и други значения, вижте хибридизация. ДНК хибридизация, хибридизация на нуклеинова киселина, in vitro комбинация от комплементарни едноверижни нуклеинови киселини в една молекула. С пълно допълване... ... Wikipedia

Метод на хибридизация на място* (in situ, лат.) се основава на способността на ДНК или РНК да образуват стабилни хибридни молекули с ДНК/РНК проби директно върху препарати от фиксирани хромозоми и интерфазни ядра. Използвайки този метод, е възможно да се определи точното местоположение на почти всяка ДНК или РНК последователност директно в клетката, клетъчното ядро или върху хромозомите.

Да се извърши хибридизация на мястоПодходящи са цитологични или хистологични препарати от клетки от всяка тъкан или орган, приготвени по стандартни методи. В клинична цитогенетична лаборатория се използват препарати от култивирани лимфоцити от периферна кръв, хорионепителни цитотрофобластни клетки, култивирани и некултивирани клетки от амниотична течност, различни тъкани от абортен материал, както и натривки от букални епителни клетки и кръв.

Метод на хибридизация на място е от особено значение за практическата цитогенетика, благодарение на разработването на неизотопен вариант, базиран на използването на проби, маркирани с нерадиоактивни модифицирани нуклеотиди. Неизотопните варианти за хибридизация върху препарати (особено флуоресцентни) имат редица предимства в сравнение с изотопните: по-голяма разделителна способност, която е равна на разделителната способност на микроскоп (0,1 - 0,2 µm), няма нужда от статистическа обработкарезултати, бързина и безопасност за здравето на изследователите

В допълнение, комбинацията от различно модифицирани проби, открити с помощта на различни системи за откриване, прави възможно едновременното определяне на местоположението на две или повече ДНК последователности в една клетка или на една метафазна плоча. А използването на повтарящи се последователности, маркирани с флуорохроми като ДНК проби, намалява времето на процедурата до 7 - 9 часа (класическата неизотопна версия на хибридизацията отнема два дни, изотопните варианти от седмица до месец), което е особено важно за пренаталното диагноза. Използване FISH методв цитогенетичната диагностика позволява да се идентифицират структурни хромозомни пренареждания, да се установи естеството на маркерните хромозоми и да се анализират числените нарушения на хромозомния набор, както върху метафазните хромозоми, така и в интерфазните ядра.

Принцип на метода FISH

В основата FISH методлежи реакцията на хибридизация между изкуствено създадена ДНК сонда и комплементарна нуклеотидна последователност на ядрена ДНК. Молекулата на ДНК се състои от две спирално свързани нуклеотидни вериги и хибридизацията е възможна само ако веригите се раздалечат. За да се разделят нуклеотидните вериги на ДНК, те прибягват до денатурация (за последваща хибридизация, както ДНК в ядрата на тестовата проба, така и самата ДНК сонда трябва да бъдат денатурирани). След денатуриране, ДНК сондата се хибридизира към своята комплементарна нуклеотидна последователност и може да бъде открита с помощта на флуоресцентен микроскоп.

Така общият изглед на протокола за настройка РИБАможе да се представи в следната форма:

1. Приготвяне на хистологичен или цитологичен препарат.
Подготовката на хистологичния препарат се извършва по стандартната процедура: изрязване, маркиране, окабеляване, запълване, микротомия, поставяне на среза върху предметно стъкло и депарафинизация. При приготвянето на цитологичен препарат се използват специални утаителни разтвори и центрофугиране, което позволява да се получи концентрирана клетъчна суспензия.

2. Предварителна обработка (при необходимост).
Лекарството се третира с протеази, за да се елиминира наличието на протеини, които възпрепятстват хибридизацията.

3. Прилагане на ДНК сонда към препарата и последваща денатурация.
За да се денатурират сондата и пробата ДНК, те се третират с формамид и се нагряват до температура около 85-90°C.

4. Хибридизация.
След денатуриране лекарството се охлажда до определена температура (37°C в случай на клинични изследвания) и се инкубира във влажна камера за няколко часа (продължителността на инкубацията е посочена във всеки конкретен протокол). Понастоящем се използват автоматични хибридизатори за денатурация и хибридизация.

5. Измиване.
След завършване на хибридизацията е необходимо да се отмият несвързаните проби, които иначе биха създали фон, който би затруднил оценката на резултатите от FISH анализа. Обикновено за изплакване се използва разтвор, съдържащ натриев цитрат и хлорид (SSC).

6. Контраоцветяване.
Използвайки флуоресцентни багрила (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; пропидиев йодид), цялата ядрена ДНК се оцветява.

7. Анализ на резултатите с помощта на флуоресцентен микроскоп. Рутинните операции (депарафинизиране, предварителна обработка, измиване) могат да бъдат автоматизирани.

* - Материалът е изготвен въз основа на информация от открити източници.