Колко далеч изминават молекулите по повърхността на мембраната? червени кръвни телца

Липозомите са в известен смисъл прототипи на клетки. Те служат като модел за изследване на естествените свойства на клетъчните мембрани.

Липозомите са намерили пряко приложение в медицината. Например, можете да затворите лекарство вътре в липозоми и да го използвате като фосфолипидна микрокапсула, за да доставяте лекарството до определени органи и тъкани. Липозомите са нетоксични (при правилен подбор на липиди), напълно се абсорбират от тялото и са в състояние да преодолеят някои биологични бариери. Така инсулинът, затворен в липозома, е защитен от действието на храносмилателните ензими. Понастоящем се проучва възможността за прилагане на това лекарство в липозоми през устата, което би могло да спаси пациентите с диабет от необходимостта от системни инжекции. Работи се по разработването на методи за липозомна терапия на тумори, ензимен дефицит и атеросклероза. Научава се възможността за целенасочено доставяне на лекарство, затворено в липозоми, до болен орган или дори до болна област (по-специално до засегнатата област на сърцето).

За да направите това, към липозомата се прикрепя протеинова молекула, антитяло към съответния мембранен антиген на целевия орган. Липозомите се пренасят през кръвния поток през целия орган и се задържат, завършвайки близо до целевия орган.

Въпреки привлекателните перспективи на липозомната терапия, все още има много неразрешени въпроси. Y~Ure

с расо. 1. 12. Образуване на плоска двуслойна мембрана

Плоските двуслойни липидни мембрани (BLM) са друг тип моделна мембрана. Такива мембрани се произвеждат през малки отвори с диаметър около 1 mm в плоча от пластмаса (например флуоропласт), потопена във водна среда. Капка липиден разтвор (в алкохол, хлороформ, хептан или други разтворители) се нанася върху отвора. Разтворителят дифундира от разтвора във водата и в отвора остава липиден филм. Тази излюнка спонтанно изтънява, докато се образува бимолекулен слой с дебелина около 6 nm. Излишната линия се събира под формата на торов ръб в краищата на отвора (фиг. 1.12).

Плоските липидни мембрани, заедно с липозомите, се използват широко като модели за изследване на електрическите свойства на мембраните, пропускливостта и други научни изследвания. Използвайки моделни мембрани, се преподават редица функции на биологичните мембрани, включително бариерни функции (например селективност на пропускливостта - добра пропускливост за вода и лоша пропускливост за йони). Биологичният транспорт може да бъде симулиран чрез въвеждане на молекули носители в моделната мембрана.

ПРОВЕРКА ВЪПРОСИ, ЗАДАЧИ, ЗАДАЧИ

1. Установено е, че специфичният електрически капацитет на мембраната на аксона, неизмерен от вътреклетъчния микроелектрод, е равен на 0,5 микрофарада / см. Използвайки формулата на плосък кондензатор, изчислете дебелината на хидрофобния слой на мембраната с диелектрична константа от 2.

2. Какво е разстоянието по повърхността на еритроцитната мембрана, което фосфолипидната молекула изминава за 1 секунда в резултат на латерална дифузия? Коефициентът на латерална дифузия се приема равен на 10 1e m"/s. Сравнете с обиколката на еритроцита с диаметър 8 микрона.

3. По време на фазовия преход на мембранните фосфолипиди от течнокристално състояние към гел дебелината на двойния слой се променя. Как изчезва електрическият капацитет на мембраната Как се променя напрегнатостта на електрическото поле в мембраната?

4. С помощта на спин-белязани фосфолипидни молекули беше установен градиент на вискозитет по дебелината на мембраната. Опишете експеримента. Където вискозитетът е по-висок: на повърхността на мембраната или в нейния център

1. От това се заключава, че мембраната на червените кръвни клетки се състои от липидни молекули, подредени в два слоя.

Очевидно това заключение на Гортер и Грендел се оказа правилно само поради взаимното компенсиране на грешките, но в историческитази работа беше от голямо значение, тъй като оттогава концепцията за липидния двоен слой като структурна основа на биологичните мембрани стана доминираща и всъщност се оказа правилна.

Концепцията за бимолекулна липидна мембрана е доразвита през 1935 г. от модела Davson-Danielli или "сандвич", който предполага, че протеините покриват повърхността на липидния двоен слой. Това беше необичайно успешен модел и през следващите 30 години множество експериментални данни, особено тези, получени с помощта на рентгенова дифракция и електронна микроскопия, напълно потвърди неговата адекватност. Тогава обаче беше открито, че мембраните изпълняват огромно разнообразие от функции и за да се обясни това явление, оригиналният модел на Davson-Danielli беше многократно модифициран.

Бърз напредък в мембранологията, което доведе до образуването модерни идеи, беше постигнато до голяма степен благодарение на напредъка в изследването на свойствата на мембранните протеини. Електронномикроскопските изследвания, използващи метода на замразяване и разцепване, показват, че глобуларни частици са вградени в мембраните. Междувременно биохимиците, използвайки детергенти, успяха да дисоциират мембраните до състояние на функционално активни „частици“. Данни от спектрални изследвания показват, че мембранните протеини се характеризират с високо съдържание на α-спирали и че е вероятно да образуват глобули, вместо да се разпределят като монослой върху повърхността на липидния двоен слой. Неполярните свойства на мембранните протеини предполагат наличието на хидрофобни контакти между протеините и вътрешната неполярна област на липидния двоен слой. В същото време бяха разработени методи, които направиха възможно разкриването на течливостта на липидния двоен слой. Сингър и Никълсън обединиха всички тези идеи, за да създадат течен мозаечен модел. В рамките на този модел мембраната е представена като течен фосфолипиден двуслой, в който са потопени свободно дифундиращи протеини. Предишният модел на Davson-Danielli беше статичен и успешно обясни структурните данни, налични по това време, получени при доста ниска резолюция. В същото време, от 1970 г., много внимание се обръща на изследването на динамичните свойства и тяхната връзка с мембранните функции. През последните години моделът на флуидна мозайка също претърпя модификации и този процес ще продължи. По-специално, сега е ясно, че не всички мембранни протеини дифундират свободно в течен липиден двоен слой. Има доказателства за съществуването на странични домени в самата мембрана. Ролята на цитоскелета също се изучава внимателно. Става все по-ясно, че някои мембранни области изглежда се различават по структура от класическия липиден двоен слой. Въпреки това, в обозримо бъдеще моделът на флуидна мозайка в неговите различни модификации ще служи като концептуална основа за много мембранни изследвания.

Два метода изиграха важна роля в изясняването на морфологията на мембраните: рентгенова дифракция и електронна микроскопия. С тяхна помощ беше потвърдена коректността на двуслойния модел. Трябва обаче да се има предвид, че и двата метода са изправени пред редица ограничения при изясняване на подробна картина на молекулярната организация на мембраните.

3.1 Рентгенова дифракция

При изследване на високо подредени кристални проби с помощта на рентгенова дифракция е възможно да се получи структурна информация с висока разделителна способност. В случай на лошо подредени лекарства, възможностите на този метод са ограничени. Някои специализирани мембранни системи вече имат правилна структура и следователно могат да бъдат изследвани чрез рентгенови дифракционни методи. Пример за този вид е миелиновата обвивка на периферните нервни влакна; това е мембрана, която многократно се увива около аксона и образува правилна система от концентрични мембранни структури. Рентгеновите дифракционни изследвания на миелина, проведени през 30-те години, потвърждават адекватността на модела на двуслойната мембрана. Същият извод се води от изследването на външния сегмент на ретиналните пръчици на гръбначните животни, които са естествено подредени мембранни системи, както и изкуствено подредени системи, които се образуват по време на колапса на мембранни везикули, получени от митохондрии и еритроцити при условия на центрофугиране. Във всички тези случаи се наблюдава подобно разпределение на електронната плътност в мембраната, показано на фиг. 1.4

За да се интерпретират данните от рентгеновата дифракция, е необходимо да се определи не само интензитетът на отраженията, но и техните фази. В случай на редовно опаковани мембранни системи, задачата е значително опростена, тъй като тези системи се състоят от повтарящи се елементи с централна симетрия.

Получените данни показват, че структурата на всички мембрани е сходна: те имат хидрофобен вътрешен регион с ниска електронна плътност и два слоя от полярни групи с висока електронна плътност. Данните от рентгенова дифракция, получени за различни мембрани, се различават само леко, въпреки големите разлики в тяхното протеиново съдържание. Въпреки че данните от рентгеновата дифракция предоставят известна информация за това как по-голямата част от мембранните протеини са разположени в мембраната, като цяло методът на рентгенова дифракция не предоставя подробна молекулярна картина.

Уилкинс и др., отбелязват през 1971 г., че рентгеновата дифракция може също да се използва за изследване на водни дисперсии на мембрани и фосфолипиди. В същото време се генерират рефлекси полярни региониот двете страни на двойния слой, позволяват да се намери дебелината му, равна на разстоянието между полярните глави, и от отраженията, генерирани от подредени въглеводородни вериги, може да се определи разстоянието между тези вериги. И в този случай мембранните препарати, получени от различни източници, дават подобен дифракционен модел, което потвърждава универсалността на двуслойния модел.

Невъзможността да се получи подробна молекулярна картина с помощта на дифракционния метод ограничава използването на този метод за изследване на биологични мембрани. Въпреки това, той може да бъде много полезен при изследването на подредени системи липиди-вода.

3.2 Електронна микроскопия

Трансмисионната електронна микроскопия на тънки участъци от миелин и всъщност всички останали мембрани разкрива характерна трислойна структура, състояща се от две електронно-плътни ленти, разделени от празнина от около 80 А. Тази картина се получава до голяма степен в резултат на обработката на препарати с осмиев тетроксид, обикновено използвани в този метод. Робъртсън нарече наблюдаваната структура "унитарна", за да подчертае нейната гъвкавост, и въпреки че молекулярните механизми на оцветяване на мембраните с осмий са неизвестни, тази структура се разглежда като подкрепа за модела на двуслойната мембрана. Ясно е обаче, че когато се подготвят проби за трансмисионна електронна микроскопия, мембраните могат да бъдат обект на неблагоприятни ефекти. По-специално, известно е, че лечението с осмиев тетроксид води до значителна загуба на протеин от еритроцитната мембрана. И въпреки че наблюдаваната в този случай трислойна структура до известна степен отразява организацията на двуслойните мембрани, по-подробна информация относно локализацията на протеините не може да бъде получена чрез този метод.

Известна информация за местоположението на мембранните протеини беше предоставена от нови методи, които вече са станали „класически“ - методите на замразяване-разцепване и замразяване-ецване. В тези случаи препаратите се замразяват бързо, без да се излагат на вредни влияния, както при получаване на тънки срезове. Процесът на приготвяне на лекарството включва следните операции.

След замразяване пробата, която представлява суспензия от клетки или мембрани, се разцепва с помощта на нож при ниска температура във висок вакуум. Силите, генерирани по време на срязване, водят до образуването на срязване, преминаващо през пробата. Оказа се, че при преминаване на срезната равнина през мембраната, последната се разделя главно по средната си част и се разделя на две половини. В резултат на това вътрешната област на мембраната е изложена върху получените равнини на разцепване.

Ако е необходимо, пробата се ецва - извършва се обичайната сублимация на лед във вакуум. Това позволява по-добра визуализация на повърхностните структури на клетъчните мембрани.

След това от откритата повърхност се получава така наречената реплика. Именно тази реплика се изследва под електронен микроскоп. За да се получи реплика, платината първо се напръсква върху пробата под ъгъл от около 45°, за да се разкрият топологичните характеристики на лекарството. След това на платиненото копие се придава механична здравина, като се покрива със слой въглерод. След това наркотикът се размразява, репликата изплува и се хваща със специална мрежа.

Повечето характерни структури, наблюдавани при изследване на мембрани чрез метода на замразяване-разцепване, са многобройни вътремембранни частици с диаметър от 80 до 100 А, разположени в равнината на мембранните разцепвания. Обикновено те са разположени хаотично, но понякога образуват групи. Многобройни изследвания показват, че тези частици може да са мембранни протеини. Любопитно е, че електронната микроскопия на тънки срезове не разкрива такива структури. Репликите, получени от двете половини на разделената мембрана, не винаги са топологично допълващи се. Това означава, че някои частици са свързани само с едната половина на мембраната. Данните за разцепване чрез замразяване бяха широко използвани от Сингър и Никълсън за разработване на флуиден мозаечен модел на мембрани, тъй като те убедително показаха, че глобуларните протеини не са разположени само на повърхността на мембраната, но и в двуслойния слой.

Фигура 1.6 показва електронна микроснимка на препарат от протеолипозоми, реконструиран от яйчен фосфатидилхолин и нефракциониран препарат от протеин лента 3 от мембраната на човешки еритроцити; Наркотикът е получен чрез замразяване - чипиране.

Протеинът от лента 3 е основен протеинов компонент на мембраната на червените кръвни клетки и е известно, че транспортира аниони. Ако фосфолипидните везикули не съдържат този протеин, тогава получените замразени чипове имат гладка повърхност.

Когато протеинът лента 3 се включи във фосфолипидните везикули, върху разцепените повърхности се появяват интрамембранни частици, практически неразличими от частиците, наблюдавани в мембраните на еритроцитите. Освен това, при рН 5,5, частиците, наблюдавани в еритроцитната мембрана, се агрегират и това агрегиране възниква в резултат на взаимодействието на протеина лента 3 с два други протеина, спектрин и актин.

Последните са компоненти на цитоскелета, разположени на вътрешната повърхност на еритроцитната мембрана. Реконструираната система, състояща се от протеин от лента 3 и фосфатидилхолин, се държи по подобен начин, като агрегацията на частиците се наблюдава в присъствието на спектрин и актин при рН 5,5, но не и при рН 7,6.

Тези данни допълнително засилиха идеята за мембранните протеини като глобуларни частици, свободно движещи се в равнината на мембраната. Интересното е, че статичните микроснимки на препарати, получени чрез метода на замразяване-разцепване, помогнаха на изследователите при изучаването на динамичните свойства на мембраните. Както ще видим, в мембраните има много протеини, които не могат да се носят свободно в липидното море.

През последните три десетилетия става все по-ясно, че по-голямата част от клетъчните функции се извършват директно от мембрани.

Както растителните, така и животинските клетки са разделени на отделения и много цитоплазмени органели, както беше показано в раздел 1.1, са от мембранен характер.

В допълнение към органелите, характерни за повечето клетки, има и специализирани мембранни системи, като саркоплазмения ретикулум на мускулните клетки, миелиновата обвивка на периферните нервни влакна, тилакоидните мембрани на хлоропластите и дисковите мембрани в пръчките на ретината. Прокариотните организми също имат мембрани, макар и не така развити като еукариотните.

Грам-положителните бактерии, като Bacillus subtilis, имат само цитоплазмена мембрана, докато грам-отрицателните бактерии, като Escherichia coli, също имат външна мембрана, разположена върху тънка пептидогликанова клетъчна стена.

Някои специализирани органели също се намират в прокариотните клетки. Някои вируси, които са патогенни за животните, като вирусите с обвивка, имат действителни мембрани и такива мембрани се оказаха изключително интересни за изследване.

Изследването на мембраните, като правило, включва тяхното пречистване и всеки тип мембрана има свои собствени условия за препаративно изолиране.

Така че, ако искате да изследвате плазмената мембрана на която и да е клетка, първо трябва да изолирате тези клетки от тъканта. След това трябва да намерите оптималните условия за унищожаване на клетките и отделяне на интересуващите ни мембрани от другите клетъчни компоненти. Критериите за чистота на изолираните мембрани заслужават специално внимание.

4.1 Разрушаване на клетките

Препоръчително е да изберете техника, която ви позволява ефективно да унищожите самите клетки, като същевременно запазите структурата на мембраните, които трябва да се изолират. За много животински клетки може да се използва относително лека процедура като хомогенизиране в хомогенизатор Dounce или Potter-Elweheim със стъклени стени с тефлоново пестило. В този случай клетките се унищожават поради сили на срязване, които възникват, когато суспензията се изтласква през тясна междина между тефлоновия пестик и стъклената стена на хомогенизатора. При тази обработка плазмената мембрана се „откъсва“ и връзките между различните органели се разрушават, като се запазва целостта на самите органели. Използвайки тази процедура, също така е възможно да се отделят специализирани области на плазмената мембрана една от друга, например базолатералните или апикалните области на мембраната на епителните клетки. Желателно е да се работи при условия, при които се поддържа целостта на органелите, за да се сведе до минимум възможността за освобождаване на хидролитични ензими и да се улеснят последващите операции за разделяне на мембраната.

За унищожаване на клетки, които имат стена, са необходими по-строги методи. Понякога, преди клетките да бъдат унищожени, те първо се третират с ензими, които разграждат компонентите на клетъчната стена, за да се улесни нейното последващо унищожаване. Например, третиране с Tris-EDTA буфер и лизозим се използва за унищожаване на клетките на Е. coli. По-строгите техники включват смилане на клетките, обработката им с ултразвук и екструдирането им. Триенето обикновено се извършва в присъствието на различни абразивни материали - пясък, алуминиев оксид или стъклени перли. Малки количества материал могат да се стриват в хаванче, но за по-големи обеми трябва да се използват специални механични устройства. Бактериалните клетки често се унищожават с ултразвук. Смята се, че в този случай разрушаването става под въздействието на срязващи сили в резултат на кавитация. Същите сили възникват при натискане на клетъчна суспензия през малък отвор, например при унищожаване на клетки с помощта на френска преса. Има много разновидности на изброените методи, като изборът им зависи от характеристиките на мембранната система, която се изследва.

Трябва да се отбележи, че мембранните фрагменти, получени по време на клетъчното разрушаване, обикновено спонтанно образуват везикули. Примерите включват:

1) микрозоми, получени от плазмената мембрана, ендоплазмения ретикулум или специализирани системи като саркоплазмената мембрана;

2) подадени митохондриални частици от вътрешната митохондриална мембрана;

3) синаптозомите, образувани при откъсване на нервните окончания в областта на синаптичните контакти;

4) бактериални мембранни везикули, образувани от плазмената мембрана на Е. coli. Везикулите се образуват и от други мембранни системи, например от мембраните на апарата на Голджи. Техният размер в повечето случаи силно зависи от метода на разрушаване на клетките. Това е особено важно, тъй като размерът на везикулите до голяма степен определя скоростта на тяхното утаяване по време на центрофугиране и тяхното поведение по време на следващите етапи на пречистване на мембраната. Някои мембрани не образуват везикули, по-специално мембраните на страничните повърхности на животинските клетки в контакт една с друга. Когато такива клетки се разрушат, двойка съседни мембранни фрагменти, държани заедно от контактната зона, се разделят. Наличието на такива контакти предотвратява затварянето на фрагментите във везикули, така че мембраните се освобождават под формата на плочи или лентовидни структури.

Голямо значениекогато клетките са унищожени, също има правилен изборзаобикаляща среда. Например, за да се поддържа затварянето на мембранните органели, трябва да се използва среда, която е изосмотична спрямо вътрешното им съдържание. Най-често за това се използва разтвор на захароза в концентрация 0,25-0,30 М. В някои случаи е по-добре да се използват сорбитол и манитол. Трябва да се отбележи, че поддържането на изотоничност също играе важна роля в следващите етапи на подготвително изолиране на непокътнати органели.

4.2 Разделяне на мембраната

В момента най-често се използва центрофугиране за разделяне на мембрани. Мембранните частици могат да бъдат класифицирани според тяхната скорост на утаяване или плаваща плътност. Първият метод се нарича зонално центрофугиране и разделянето става според S стойностите, а вторият е изопикнично центрофугиране и разделянето става при условия на равновесна плътност. На практика обикновено се използва някакъв хибрид на тези два метода. Фигура 1.7 показва позицията на някои субклетъчни единици в координатната равнина "S-g".

Абсцисната ос показва коефициентите на утаяване на частиците, а ординатната ос показва плътността.

Принципът на разделяне чрез скорост на утаяване може лесно да бъде разбран чрез сравняване на S стойностите за различни фракции. Например, ядрата имат относително високи стойности на S, т.е. тяхната скорост на утаяване е значително по-висока от тази на повечето други субклетъчни органели. Ядрата могат да бъдат селективно пелетирани чрез центрофугиране на клетъчния хомогенат, оставяйки всички други органели в супернатантата. В същото време гладкият и грапавият ендоплазмен ретикулум не могат да бъдат разделени чрез зонално центрофугиране.

Разликите в тяхната плътност често се използват за изолиране на различни мембранни фракции от клетъчен хомогенат. За целта се извършва центрофугиране в градиент на плътност. Най-често захарозата се използва за създаване на градиент на плътност, но този метод има сериозни недостатъци. За да се получи плътността, необходима за разделяне на различните мембранни фракции, е необходимо да се приготвят разтвори с високи концентрации на захароза, които имат висок вискозитет и също са хипертонични. Въвеждането на субклетъчни органели в хипертоничен разтвор на захароза води до тяхната дехидратация и последващото довеждане на разтвора до изотонични условия често е придружено от лизис и увреждане на органелите. Друг проблем е, че много мембранни органели са пропускливи за захарозата. Това също може да доведе до осмотично разрушаване на органелите. Проникването на захароза в отделените мембранни органели може да промени тяхната ефективна плътност.

Таблица 1.1. Физическото време все повече използва други медии, за да създаде градиент на плътност. Някои от тези среди са изброени в таблица 1.1

За решаване на тези проблеми, най-новите свойства на градиентните медии.

1. Фикол. Хидрофилен полимер на захароза с високо молекулно тегло, който може да се използва за получаване на разтвори с плътност до 1,2 g/ml.Основното му предимство е ниското осмотично налягане на разтворите в сравнение с разтвори с еквивалентна концентрация на захароза.Благодарение на това, възможно е да се създадат разтвори, които са изотонични в целия диапазон от концентрации поради допълнителното включване на захароза или физиологично приемливи соли в средата. Недостатъците са високият вискозитет на получените разтвори и значително нелинейната зависимост на вискозитета и осмоларитета от концентрацията.

2. Метризамид. Разтворите на трийод-заместен глюкозен бензамид Метризамид имат по-висока плътност от разтворите на Ficoll при същите концентрации. Основното предимство на разтворите на метризамид е техният много нисък вискозитет, което позволява по-бързо разделяне.35% разтвор на метризамид има почти физиологичен осмоларитет, така че повечето от операциите за разделяне на мембраната могат да се извършват без излагането им на хипертонични разтвори. Натриевият метризоат е съединение, родствено на метризамида, с подобни свойства, с единствената разлика, че разтворът му е изотоничен при концентрация от около 20%. Натриевият метризоат се използва предимно за изолиране на непокътнати клетки. Nicodenz също е производно на трийодобензоената киселина, но има три хидрофилни странични вериги. Когато се центрофугира, той бързо образува свой градиент на плътност; използвани за изолиране на субклетъчни органели.

Перкол. Колоидна суспензия от силикагел, чиито частици са покрити с поливинилпиролидон. Това покритие намалява токсичните ефекти на силикагела. Основното предимство на Percoll е, че не прониква през биологичните мембрани, а разтворите му имат нисък вискозитет и нисък осмоларитет. Поради големия размер на частиците центрофугирането на разтвора на Percoll при умерени скорости води до образуването на градиент на плътност. Следователно раздялата обикновено настъпва много бързо. Средата, използвана за центрофугиране, може да бъде изотонична в целия си обем поради включването на соли или захароза. Не е трудно да се създаде лек градиент, който позволява много ефективно разделяне на мембранните фракции въз основа на тяхната плаваща плътност.

Сорбитол и манитол. Тези вещества понякога се използват вместо захароза, тъй като, според публикувани данни, те проникват през някои биологични мембрани по-слабо от захарозата.

Имайте предвид, че глицеролът не се използва за създаване на градиент на плътност, тъй като не може да постигне достатъчно високи стойности на плътност. Соли на алкални метали, като CsCl, се използват само когато са необходими разтвори с висока плътност. Но трябва да се има предвид, че в концентрациите, необходими за създаване на равновесна плътност, тези соли често имат увреждащ ефект върху мембранните органели.

Други методи също се използват за изолиране на мембрани от клетъчни хомогенати, макар и не толкова често, колкото центрофугирането.

1. Фазово разпределение. В този случай разделянето на мембранните частици става в съответствие с техните повърхностни свойства. За тази цел се образуват два несмесващи се слоя от водни разтвори на различни водоразтворими полимери. Пример е смес от полиетилен гликол декстран и декстран фикол. Мембранните частици се разделят според афинитета им към тези фази. Последните могат да бъдат избрани така, че да разделят мембраните според техния повърхностен заряд или хидрофобност.

Електрофореза с непрекъснат свободен поток. В този случай разделянето на частиците става в съответствие с техния електрически заряд. Лекарството, което трябва да се отдели, непрекъснато се въвежда в тънък слой буфер, който тече надолу по вертикална стена. В този случай електрическо поле се прилага перпендикулярно на посоката на потока. По този начин електрофоретичното разделяне на частиците се извършва през протичащия буфер, който се събира на дъното на камерата под формата на отделни фракции.

Афинитетна адсорбция. Разделянето се основава на биоспецифичното взаимодействие между компонентите на мембраната и твърдата фаза. С откриването на моноклоналните антитела стана възможно да се създадат препаративни техники, базирани на използването на специфични антигенни компоненти за изолиране на мембрани. Получените антитела могат да бъдат ковалентно прикрепени към твърда подложка и с тяхна помощ да осъществят специфично свързване на съответните мембрани. Този метод най-често се използва за изолиране на мембранни протеини. Един от проблемите, които възникват тук, е свързан с избора на условия за елуиране на мембраната, които не биха причинили денатурация на протеина.

Метод, базиран на използването на микрогранули от силикагел. Обикновено плазмените мембрани представляват не повече от 1°7o от общата маса на всички мембрани на еукариотните клетки. Следователно изолирането на абсолютно чисти плазмени мембрани е изпълнено с големи трудности. Един подход, който е разработен специално за изолиране на плазмени мембрани, се основава на използването на катионизирани микрозърна от силикагел. Тези гранули са силно адсорбирани към външната повърхност на плазмената мембрана на непокътнати клетки и фракцията от плазмени мембрани, свързана с гранулите, лесно се отделя по градиента на плътност на захарозата от други мембрани поради по-високата плътност на гранулите. Особеността на този метод е, че в получения препарат плазмената мембрана с вътрешната й повърхност се превръща в разтвор.

4.3 Критерии за чистота на мембранните фракции

Може би най-обективният критерий за чистотата на изолираната мембранна фракция е наличието в нея на всеки уникален компонент, който се съдържа само в тази мембрана или е преобладаващ в нея. Обикновено такива компоненти са ензими, които в този случай се наричат ​​маркери. Списък на маркерните ензими, които се използват за контрол на чистотата на мембранните фракции, е даден в таблица 1.2. При определяне на активността на ензима трябва да се има предвид, че той може да бъде в латентна форма, например поради факта, че че е локализиран върху вътрешната повърхност на секретирани мембранни везикули. Други проблеми, свързани с оценката на чистотата на изолирани мембрани, са обсъдени в прегледа. Трябва да се отбележи, че препоръчителните методи в повечето случаи са доста добре установени и стандартизирани.

В някои случаи по-удобни мембранни маркери не са ензими, а специфични рецептори за лектини, хормони, токсини или антитела. Ако изследваните системи са добре характеризирани, тогава чистотата на мембранната фракция може да се съди по нейния протеинов състав, определен чрез електрофореза с полиакриламиден гел в присъствието на натриев додецилсулфат. Например, външната мембрана на грам-отрицателните бактерии има характерен набор от полипептиди, които не се намират в цитоплазмената мембрана.

Таблица 1.2 Маркери, използвани за контрол на чистотата на мембранни фракции, изолирани от клетки на бозайници "

Други критерии, по които може да се съди за чистотата на мембраните, включват тяхната морфология, разкрита чрез електронна микроскопия, и характеристики химичен състав. Например, фракции, представляващи плазмената мембрана, апарата на Голджи или митохондриите, могат да бъдат идентифицирани по тяхната морфология. В някои случаи лекарството се характеризира със съдържанието на холестерол. Например митохондриалните мембрани съдържат много по-малко холестерол от мембраните на апарата на Голджи и плазмените мембрани.

Има молекули детергент на мицел. При изследванията на мембраните се използва доста ограничен набор от детергенти. В табл 1 са представени тези, които най-често се използват за солюбилизация и реконструкция на мембрани. Тези детергенти се характеризират с доста високи стойности на CMC (10-4-10-2 M) и факта, че принадлежат към категорията на така наречените меки детергенти, т.е.

Образуването на двуслоен слой е специално имуществолипидни молекули и се реализира дори извън клетката. Най-важните свойства на двуслойния слой: - способност за самосглобяване - течливост - асиметрия. 1.2. Въпреки че основните свойства на биологичните мембрани се определят от свойствата на липидния двоен слой, повечето специфични функции се осигуряват от мембранните протеини. Повечето от тях проникват през двуслойния слой под формата на единична...

Липозомите или фосфолипидните везикули (везикули) обикновено се получават чрез набъбване на сухи фосфолипиди във вода или чрез инжектиране на разтвор на липиди във вода. В този случай се получава самосглобяване на бимолекулна липидна мембрана. Минималната енергия на Гибс съответства на затворената сферична еднопластова форма на мембраната. В този случай всички неполярни хидрофобни опашки са разположени вътре в мембраната и нито една от тях не влиза в контакт с полярни водни молекули (фиг. 1.11). Но по-често се получават несферични многослойни липозоми, състоящи се от няколко бимолекулни слоя - многослойни липозоми.

Ориз. 1.11.Схема на структурата на еднослойна липозома

Отделните бимолекулни слоеве на многослойна липозома са разделени от водна среда. Дебелината на липидните слоеве е в зависимост от природата на липидите 6,5 - 7,5 nm, а разстоянието между тях е 1,5 - 2 nm. Диаметърът на многослойните липозоми варира от 60 nm до 400 nm или повече.

Еднослойни липозоми могат да бъдат получени по различни методи, например от суспензия на многослойни липозоми чрез третирането им с ултразвук. Диаметърът на еднослойните липозоми, получени по този метод, е 25-30 nm. Разработени са и други методи за производство на еднослойни липозоми, включително такива с диаметър до 400 nm или повече.

Липозомите са по някакъв начин прототип на клетка. Те служат като модел за изследване на различни свойства на клетъчните мембрани.

Липозомите са намерили пряко приложение в медицината. Например, лекарство може да бъде затворено в липозоми и използвано като фосфолипидна микрокапсула за доставяне на лекарството до специфични органи и тъкани. Липозомите са нетоксични (при правилен подбор на липиди), напълно се абсорбират от тялото и са в състояние да преодолеят някои биологични бариери. Така инсулинът, затворен в липозома, е защитен от действието на храносмилателните ензими. Понастоящем се проучва възможността за прилагане на това лекарство в липозоми през устата, което би могло да спаси пациентите с диабет от необходимостта от системни инжекции. Работи се по разработването на методи за липозомна терапия при тумори, ензимен дефицит и атеросклероза. Проучва се възможността за целенасочено доставяне на лекарство, затворено в липозоми, до болен орган или дори до болна област (по-специално до засегнатата област на сърцето).

За да направите това, към липозомата се прикрепя протеинова молекула - антитяло към съответния мембранен антиген на целевия орган. Липозомите се пренасят през кръвния поток в цялото тяло и се задържат, след като са близо до целевия орган.

Въпреки привлекателните перспективи на липозомната терапия, все още има много нерешени въпроси.

Ориз. 1.12.Образуване на плоска двуслойна липидна мембрана

Плоски двуслойни липидни мембрани (BLMs) -друг тип моделни мембрани. Такива мембрани се произвеждат върху малки отвори с диаметър около 1 mm в пластмасова плоча (например флуоропласт), потопена във водна среда. Капка липиден разтвор (в алкохол, хлороформ, хептан или други разтворители) се нанася върху отвора. Разтворителят дифундира от разтвора във водата, оставяйки филм от липиди върху отвора. Този филм изтънява спонтанно, докато се образува бимолекулен слой с дебелина около 6 nm. Излишните липиди се събират под формата на торусен ръб по краищата на отвора (фиг. 1.12).

Планарните липидни мембрани, заедно с липозомите, се използват широко като модели за изследване на електрическите свойства на мембраната, пропускливостта на мембраната и други научни изследвания. С помощта на моделни мембрани се изследват редица функции на биологичните мембрани, включително бариерни функции (например селективност на пропускливостта - добра пропускливост за вода и лоша пропускливост за йони). Биологичният транспорт може да бъде симулиран чрез въвеждане на молекули носители в моделната мембрана.

тестови въпроси, задачи, задания

1. Специфичният електрически капацитет на мембраната на аксона, измерен чрез вътреклетъчен микроелектрод, се оказа равен на 0,5 микрофарада / cm 2. Използвайки формулата на плосък кондензатор, изчислете дебелината на хидрофобния слой на мембраната с диелектрична константа 2.

2. Какво разстояние изминава молекулата на фосфолипида по повърхността на еритроцитната мембрана за 1 секунда в резултат на страничната дифузия? Коефициентът на странична дифузия се приема за 10~ 12 m 2 /s. Сравнете с обиколката на червени кръвни клетки с диаметър 8 микрона.

3. По време на фазовия преход на мембранните фосфолипиди от течнокристално състояние към гел дебелината на двойния слой се променя. Как ще се промени електрическият капацитет на мембраната? Как ще се промени силата на електрическото поле в мембраната?

4. С помощта на спин-белязани фосфолипидни молекули беше установен градиент на вискозитет по дебелината на мембраната. Опишете експеримента. Къде вискозитетът е по-висок: на повърхността на мембраната или в нейния център?

стандартни текущи контролни тестове

1.1. Дебелина на биологичната мембрана:

1. 10 A 3.0.1 µm

2. 10 nm 4. 10 µm

1.2. Течният мозаечен модел на биологична мембрана включва:

1. протеинов слой, полизахариди и повърхностни липиди!

2. липиден монослой и холестерол

3. липиден двуслой, протеини, микрофиламенти

4. липиден двуслой

1.3. Липидната част на биологичната мембрана е в следното физическо състояние:

1. течен аморфен

2. твърд кристален

3. твърд аморфен

4. течен кристал

1.4. Специфичен електрически капацитет на мембраната на аксона:

1. 0.5 10 -4 F/m 2 3. 0.5 10 -2 F/cm 2

2. 0,5 Yu -2 F/m 2 4. 0,5 10 -12 F/m 2

1.5. Характерното време на прехвърляне на фосфолипидната молекула от едно равновесно положение в друго по време на тяхната дифузия:

страничен джапанка

1. 10 -7 – 10 -8 ~1 час

2. 10 -10 – 10 -12 10 -7 – 10 -8 s

3. 1 – 2 часа 10 – 50 s

1.6. Фазовият преход на липидния двоен слой на мембраните от течнокристално състояние към гел се придружава от:

1. изтъняване на мембраната

2. дебелината на мембраната не се променя

3. удебеляване на мембраната

ГЛАВА 2. ТРАНСПОРТ НА ВЕЩЕСТВА ПРЕЗ БИОЛОГИЧНИ МЕМБРАНИ

Живи системи на всички нива на организация - отворени системи. Следователно транспортът на вещества през биологичните мембрани е необходимо условиеживот. С преноса на вещества през мембраните са свързани клетъчните метаболитни процеси, биоенергийните процеси, образуването на биопотенциали, генерирането на нервен импулс и др.. Нарушаването на транспорта на вещества през биомембраните води до различни патологии. Лечението често включва проникване на лекарства през клетъчните мембрани. Ефективността на лекарството до голяма степен зависи от пропускливостта на мембраната.

Концепцията за електрохимичен потенциал е от голямо значение за описване на транспорта на веществата.

Химическият потенциал на дадено вещество μ k е стойност, числено равна на енергията на Гибс за един мол от това вещество. Математически химическият потенциал се определя като частната производна на енергията на Гибс G по отношение на количеството k-ro на веществото при постоянна температура T, налягане P и количествата на всички други вещества m 1 (l≠k):

За разреден разтвор с концентрация на вещество С:

където μ Q е стандартният химичен потенциал, числено равен на химичния потенциал на дадено вещество при неговата концентрация от 1 mol/l в разтвор.

Електрохимичен потенциал μ е стойност, числено равна на енергията на Гибс G за един мол от дадено вещество, поставено в електрическо поле.

За разредени разтвори

където F = 96500 C/mol е числото на Фарадей, Z е зарядът на електролитния йон (в единици елементарен заряд), φ е потенциалът на електрическото поле, T [K] е температурата.

Транспортът на вещества през биологичните мембрани може да бъде разделен на два основни типа: пасивен и активен.

1. Опитите на Pfeffer, Hardy-Fisher, Overton. Природата на клетъчната мембрана и алтернатива на клетъчната мембрана.

2. Методът на флуоресцентните сонди при изследване на клетъчни мембрани.

3. Специфичният електрически капацитет на мембраната на аксона, измерен с вътреклетъчен електрод, се оказа равен на 0,5 μF/cm 2. Използвайки формулата на плосък кондензатор, определете дебелината на хидрофобния слой на мембраната. Ε на липидите се счита за равно на 2.

4. Механизъм на генериране на акционния потенциал на кардиомицета.

5. Метод със спинова сонда при изследване на клетъчни мембрани.

6. Какво разстояние изминава фосфолипидната молекула по повърхността на еритроцитната мембрана за 1 секунда в резултат на латерална дифузия? Коефициентът на странична дифузия се приема равен на 10 -12 m 2 / s. сравнете с обиколката на еритроцит с диаметър 8 микрона.

7.Структура на йонния канал.

8.Метод на диференциалната микрокалориметрия.

9. По време на фазовия преход на мембранните фосфолипиди от течнокристално състояние към гел дебелината на двойния слой се променя. Как ще се промени електрическият капацитет на мембраната?

10.Йонни канали на клетъчните мембрани.

11. Рентгеноструктурен анализ при изследване на клетъчни мембрани. Принципи и примери.

12. По време на фазовия преход на мембранните фосфолипиди от течнокристално състояние към гел дебелината на двойния слой се променя. Как ще се промени силата на електрическото поле в мембраната?

13.Йонни токове в аксона. Модел на Ходжкин-Хъксли.

14. Методи за изследване на мембранната пропускливост.

15. Използвайки белязани със спин фосфолипидни молекули, беше установен градиент на дебелината на вискозитета в мембраната. Опишете експеримента.

16. Механизъм на генериране на акционен потенциал.

17. Приложение на кондуктометрията при изследване на мембрани. Експериментите на Фрике.

18. Където вискозитетът на хидрофобния слой е по-висок: на повърхността на мембраната или в нейната дебелина. Как се инсталира това?

19. Разпространение на нервен импулс по възбудимо влакно.

20. Електрокинетични явления в клетки и суспензии.

21. Как ще се промени улеснената дифузия на калиеви йони с участието на молекулата на валиномицин след фазовия преход на мембранните липиди от течнокристално състояние към гел?

22. Потенциал за действие. физически механизъм.

23. Електрокосмос в живи клетки и тъкани.

24. Ще се наблюдава ли осмотичен ефект (набъбване в хипотонични разтвори и свиване в хипертонични разтвори) при натрупване на натриеви йони по антипортовата схема?

25. Потенциал за почивка. Природата му.

26. Същност на осмозата в живите клетки.

27. Ще има ли осмотичен ефект (набъбване в хипотонични разтвори и свиване в хипертонични разтвори), когато натриевите йони се натрупват според схемата на симпорт?

28. Същност на биоелектричните потенциали.

29. Клетката е като осмометър. Пример за определяне на изотоничността на разтвор с помощта на живи клетки.

30. Покажете, че уравнението на Нернст-Планк се свежда до уравнението на Фик за случай на дифузия на незаредени частици.

31. Разлики между протеинови канали и липидни пори.

32. Характер на утаяването на мъртвите клетки. Физико-химични основи на метода ESR.

33. Ензимът Na + -K + - АТФ-аза в плазмената мембрана на еритроцит завършва шест цикъла. Колко натриеви и калиеви йони са били активно транспортирани? Колко енергия е изразходвана в този случай, ако хидролизата на един мол АТФ е придружена от освобождаване на 33,6 kJ? Считайте, че ефективността на свързване е 100%.

34.механизъм на мембранната пропускливост за водните молекули. Кинк хипотеза.

35. ЯМР спектроскопия при изследване на мембрани. Примери и принципи.

36. в клетъчни мембраниИзвестни са три йонни помпи: натриево-калиева, протонна и калциева. Как се осъществява активният транспорт на захарта и аминокиселините?

37.модел на образуване на пори по време на фазов преход.

38.методи за измерване на микровискозитет в мембрани.

39. Възможен ли е едновременен трансмембранен трансфер на калиеви и натриеви йони според схемата на симпорт?

40.електрически разпад на мембранните липиди.

42.спектрално-сондови методи.

43. Възможен ли е едновременен трансмембранен трансфер на калиеви и натриеви йони според схемата на антипорт?

44.модел на критична липидна пора.

45.използване на йон-селективни електроди при изследване на пропускливостта на мембраната.

46. ​​​​Възможен ли е едновременен трансмембранен трансфер на калиеви и натриеви йони според схемата на еднопорт?

47.липидни пори в светлината на стабилността на мембраната.

48. Методи за еритрограма. Тяхната информационна стойност.

49. Какъв вид йонен транспорт създава мембранна потенциална разлика: пасивен или активен?

50.механизъм и модели на вторичен активен транспорт на йони.

51. експериментални критерии за улеснена дифузия.

52. Каква е по-голямата скорост на разпространение на електрически сигнал по проводниците на морски телеграф или скоростта на разпространение на нервен импулс по мембраната на аксона? Защо?

53. Електрогенни йонни помпи.

54. Методи за клетъчно фракциониране.

55. Какъв е биофизичният механизъм на действие на местния анестетик тетраил амоний?

56. Опитът и схемата на Усинг.

57. Природата на силите на липидно-липидното взаимодействие в мембраната. Изследователски методи.

Календарно тематичен план по дисциплината

"Молекулярна организация на биологичните мембрани"

2011/2012 учебна година година (4-та година, 7-ми семестър WBF по биофизика)

* - всяко практическо занятие е с продължителност 4 часа.

Одобрено на заседание на катедрата ________________________________________________

Кръв и червени кръвни клетки. Продължаваме да публикуваме материали за кръвта.

Как изглежда червените кръвни клетки? При нормални физиологични условия в кръвния поток червените кръвни клетки имат двойновдлъбната форма с равномерни удебеления по ръбовете и централна по-светла част - бледност.

При светлинен оптичен преглед нормален еритроцит, рутинно оцветен с киселинни багрила, има формата на диск с диаметър 6,9-7,7 и до 9,0 микрона. В зависимост от размера си червените кръвни клетки се разделят на микро- и макроцити, но основната им част са представени от нормоцити/дискоцити.

Морфофункционални свойства на еритроцитите

Еритроцитът е безядрена двойновдлъбната клетка със среден обем от 90,0 µm 3 и площ от 142 µm 2. Максималната му дебелина е 2,4 микрона, минималната е 1 микрон.

В изсушения препарат средният размер на червените кръвни клетки е 7,55 микрона; 95% от сухото му вещество идва от желязосъдържащия протеин хемоглобин и само 5% от други вещества (други протеини и липиди). Такива клетки представляват абсолютното мнозинство - над 85% - от червените кръвни клетки на здравия човек.

Ядрените форми на еритроцитната линия се различават лесно от повечето клетки от левкоцитната линия по липсата на гранули в тяхната цитоплазма (грешки са възможни само при идентифициране на бластни клетки). Еритробластите имат по-гранулиран и плътен ядрен хроматин.

Централната кухина (бледност) на еритроцитния диск заема от 35 до 55% от повърхността му, а в напречно сечение еритроцитите имат формата на поничка, което, от една страна, осигурява запазването на хемоглобина, а от друга друго, позволява на еритроцита да премине дори през най-тънките капиляри. Наличните в момента модели на структурата на еритроцита съответстват на идеята за специфичните свойства на тази клетка, особено на нейната обвивка, която въпреки чувствителността си към деформиращо налягане осигурява устойчивост на огъване и увеличаване на общата повърхност.

Литературните данни показват, че размерът и деформируемостта на еритроцитната мембрана са техни най-важните характеристики, с които е свързано нормалното функциониране на тези клетки, включително висока миграционна способност, участие в метаболитните процеси (предимно в обмена на кислород).

Промените в микроеластометричните свойства на еритроцитите и "трансформацията" на дискоцитите в други морфологични форми могат да бъдат причинени от различни агенти. По този начин появата на повърхностни израстъци води до намаляване на еластичността на мембраната, което може да се дължи на противоположни сили, възникващи в самия процес на деформация на еритроцита; деформацията се увеличава с намаляване на концентрацията на АТФ в клетките.

Ако се наруши целостта на клетъчната мембрана, еритроцитът губи характерната си форма и се превръща в сферопласт, който от своя страна се хемолизира. Структурата на мембраната на еритроцитите (дискоцитите) е еднаква навсякъде; и въпреки факта, че вдлъбнатини и издутини могат да се появят в различните й части, промените във вътрешно- или извънклетъчното налягане с разпределение от ±15% не причиняват свиване на цялата клетка, тъй като тя има значителен резерв от „антидеформируемост“ . Мембраната на еритроцитите има достатъчна еластичност, за да издържи на въздействието на различни фактори, които възникват по време на циркулацията на еритроцитите през кръвния поток.

Съставът на еритроцитната мембрана включва: фосфолипиди (36,3%), сфингомиелини (29,6%), холестерол (22,2%) и гликолипиди (11,9%). Първите два елемента са амфифилни молекули водна среда, образувайки характерен липиден двоен слой, който също е проникнат от интегрални протеинови молекули, свързани вътре в еритроцита с неговия цитоскелет.

Мембранните липиди са в течно състояние и имат нисък вискозитет (само 10-100 пъти вискозитета на водата). На външната повърхност на мембраната има липиди, сиалова киселина, антигенни олигозахариди и адсорбирани протеини; вътрешната повърхност на мембраната е представена от гликолитични ензими, натрий и калций, АТФаза, гликопротеини и хемоглобин.

Липидният двуслой на мембраната изпълнява три функции: бариерна функция за йони и молекули, структурна основа за функционирането на рецептори и ензими (протеини, гликопротеини, гликолипиди) и механична. При осъществяването на специализирана дихателна функция - транспортирането на кислород или въглероден диоксид - основната роля играят мембранните протеини, „вградени“ в липидния двоен слой. Зрелите червени кръвни клетки не са способни да синтезират нуклеинови киселини и хемоглобин; характерни за тях ниско нивообмен, което осигурява доста дълъг период на живот на тези клетки (120 дни).

Когато червените кръвни клетки стареят, тяхната повърхност намалява, докато съдържанието на хемоглобин остава непроменено. Установено е, че в „зряла“ възраст червените кръвни клетки поддържат постоянен химичен състав за дълго време, но с напредването на възрастта съдържанието на клетките намалява. химически веществапостепенно намалява. Цитоскелетът на еритроцитите се формира и контролира от мултигенни и мембранно-асоциирани протеинови "семейства", които организират специализирани мембранни домени, които поддържат функцията и формата на тази високоспециализирана клетка.

Електрически потенциал на червени кръвни клетки

Еритроцитната мембрана съдържа 50% протеини, до 45% липиди и до 10% въглехидрати. На повърхността на непокътнати клетки "мрежовото" разпределение на зарядите се определя от гликопротеин, съдържащ сиалова (неутрамова) киселина, която определя до 62% от повърхностния отрицателен заряд на клетката.

Смята се, че всеки електрически заряд съответства на 1 молекула от тази киселина. Загубата на сиалова киселина от повърхността на еритроцита води до намаляване на неговата електрофоретична подвижност (EPM) и потискане на катионния транспорт. Следователно на повърхността на клетките има "мозайка" от заряди, определени от катионни и анионни групи, чието съотношение определя общия електрически заряд на еритроцитите.

За поддържане на оптимално състояние на хомеостаза профилирани елементикръвта трябва да има стабилен заряд. Високата стабилност на EPP се осигурява от фин механизъм на неговото регулиране - баланса на процесите на липидна пероксидация (LPO) в мембраните на еритроцитите и защитния ефект на антиоксидантната система.

Емпирично е установено, че рецепторите за антитела се намират върху мембраната на еритроцитите и наличието дори на малко количество от тях на повърхността може да наруши нормалните физиологични функции в организма и да промени EFP на еритроцитите. Това може да повлияе на нивото на хемоглобина в последния, тъй като съдържанието на хемоглобин и EPP са строго координирани.

Трябва също така да се има предвид, че при екстремно въздействие върху тялото на отрицателни фактори, продуктите на липидната пероксидация влияят върху електрокинетичните свойства на еритроцитите. От своя страна това се отразява в скоростта на пероксидните процеси в техните мембрани.

Благодарение на електростатичното отблъскване ("тласък" според Чижевски) на еднакво заредени червени кръвни клетки, последните се движат свободно през кръвоносните съдове, изпълнявайки своята функция за транспортиране на кислород. Следователно нарушението на стабилността на заряда може да се счита за интегрален индикатор за патологични промени в тялото.