Генетичният материал на еукариотните организми има много сложна организация. ДНК молекулите, разположени в клетъчното ядро, са част от специално многокомпонентно вещество - хроматин.
Дефиниция на понятието
Хроматинът е материалът на клетъчното ядро, съдържащ наследствена информация, който представлява сложен функционален комплекс от ДНК със структурни протеини и други елементи, които осигуряват опаковането, съхранението и внедряването на кариотния геном. В опростена интерпретация това е веществото, от което са изградени хромозомите. Терминът идва от гръцкия "хром" - цвят, боя.
Концепцията е въведена от Флеминг през 1880 г., но все още има дебат за това какво е хроматин по отношение на биохимичния състав. Несигурността засяга малка част от компонентите, които не участват в структурирането на генетичните молекули (някои ензими и рибонуклеинови киселини).
При електронната фотография на интерфазното ядро хроматинът се визуализира като множество области от тъмна материя, които могат да бъдат малки и разпръснати или комбинирани в големи плътни клъстери.
Кондензацията на хроматин по време на клетъчното делене води до образуването на хромозоми, които се виждат дори в конвенционален светлинен микроскоп.
Структурни и функционални компоненти на хроматина
За да определят какво представлява хроматинът на биохимично ниво, учените извличат това вещество от клетките, прехвърлят го в разтвор и в тази форма изследват неговия компонентен състав и структура. Използвани са както химични, така и физични методи, включително технологии за електронна микроскопия. Оказа се, че химичният състав на хроматина е 40% представен от дълги ДНК молекули и почти 60% от различни протеини. Последните се делят на две групи: хистони и нехистони.
Хистоните са голямо семейство от основни ядрени протеини, които се свързват здраво с ДНК, образувайки структурния скелет на хроматина. Техният брой е приблизително равен на процента на генетичните молекули.
Останалата част (до 20%) от протеиновата фракция се състои от ДНК-свързващи и пространствено модифициращи протеини, както и ензими, участващи в процесите на четене и копиране на генетична информация.
В допълнение към основните елементи, рибонуклеинови киселини (РНК), гликопротеини, въглехидрати и липиди се намират в малки количества в хроматина, но въпросът за тяхната връзка с ДНК опаковъчния комплекс все още е отворен.
Хистони и нуклеозоми
Молекулното тегло на хистоните варира от 11 до 21 kDa. Големият брой основни аминокиселинни остатъци лизин и аргинин придават на тези протеини положителен заряд, насърчавайки образуването на йонни връзки с противоположно заредените фосфатни групи на двойната спирала на ДНК.
Има 5 вида хистони: H2A, H2B, H3, H4 и H1. Първите четири типа участват в образуването на основната структурна единица на хроматина - нуклеозомата, която се състои от ядро (протеиново ядро) и ДНК, обвита около него.
Ядрото на нуклеозомата е представено от октамерен комплекс от осем хистонови молекули, който включва тетрамер H3-H4 и димер H2A-H2B. ДНК секция от около 146 нуклеотидни двойки се навива върху повърхността на протеиновата частица, образувайки 1,75 навивки и преминава в линкерна последователност (приблизително 60 bp), свързваща нуклеозомите една с друга. Молекулата Н1 се свързва с линкерната ДНК, предпазвайки я от действието на нуклеазите.
Хистоните могат да претърпят различни модификации, като ацетилиране, метилиране, фосфорилиране, ADP-рибозилиране и взаимодействие с убиквитин протеин. Тези процеси влияят върху пространствената конфигурация и плътността на опаковане на ДНК.
Нехистонови протеини
Има няколкостотин вида нехистонови протеини с различни свойства и функции. Тяхното молекулно тегло варира от 5 до 200 kDa. Специална група се състои от сайт-специфични протеини, всеки от които е комплементарен към специфичен регион на ДНК. Тази група включва 2 семейства:
- “цинкови пръсти” – разпознават фрагменти с дължина 5 нуклеотидни двойки;
- хомодимери – характеризиращи се със структура спирала-завой-спирала във фрагмента, свързан с ДНК.
Най-добре проучени са така наречените протеини с висока подвижност (HGM протеини), които са постоянно свързани с хроматина. Семейството получи това име поради високата скорост на движение на протеиновите молекули в гел за електрофореза. Тази група заема по-голямата част от нехистоновата фракция и включва четири основни типа HGM протеини: HGM-1, HGM-14, HGM-17 и HMO-2. Те изпълняват структурни и регулаторни функции.
Нехистоновите протеини също включват ензими, които осигуряват транскрипция (процес на синтез на информационна РНК), репликация (удвояване на ДНК) и възстановяване (елиминиране на увреждане в генетичната молекула).
Нива на уплътняване на ДНК
Особеността на структурата на хроматина е такава, че позволява нишки на ДНК с обща дължина над един метър да се поберат в ядро с диаметър около 10 микрона. Това е възможно благодарение на многоетапна система за опаковане на генетични молекули. Общата схема на уплътняване включва пет нива:
- нуклеозомна нишка с диаметър 10–11 nm;
- фибрил 25–30 nm;
- кръгови домейни (300 nm);
- влакно с дебелина 700 nm;
- хромозоми (1200 nm).
Тази форма на организация осигурява намаляване на дължината на оригиналната ДНК молекула с 10 хиляди пъти.
Нишка с диаметър 11 nm се образува от редица нуклеозоми, свързани с ДНК линкерни области. На електронна микроснимка такава структура прилича на мъниста, нанизани на въдица. Нуклеозомната нишка се сгъва в спирала като соленоид, образувайки фибрила с дебелина 30 nm. Хистон Н1 участва в образуването му.
Соленоидната фибрила се сгъва в бримки (иначе известни като домейни), които са закотвени към поддържащата вътрешноядрена матрица. Всеки домейн съдържа от 30 до 100 хиляди базови двойки. Това ниво на уплътняване е характерно за интерфазния хроматин.
Структура с дебелина 700 nm се образува чрез спирализиране на фибрила на домен и се нарича хроматид. От своя страна двете хроматиди образуват петото ниво на организация на ДНК - хромозома с диаметър 1400 nm, която става видима на етапа на митоза или мейоза.
По този начин хроматинът и хромозомата са форми на опаковане на генетичен материал, които зависят от жизнения цикъл на клетката.
Хромозоми
Хромозомата се състои от две идентични сестрински хроматиди, всяка от които е образувана от една свръхнавита ДНК молекула. Половинките са свързани чрез специално фибрилно тяло, наречено центромер. В същото време тази структура е стеснение, което разделя всеки хроматид на рамена.
За разлика от хроматина, който е структурен материал, хромозомата е дискретна функционална единица, характеризираща се не само със структура и състав, но и с уникален генетичен набор, както и с определена роля в осъществяването на механизмите на наследствеността и променливостта при клетъчно ниво.
Еухроматин и хетерохроматин
Хроматинът в ядрото съществува в две форми: по-малко спираловиден (еухроматин) и по-компактен (хетерохроматин). Първата форма съответства на транскрипционно активни региони на ДНК и следователно не е толкова тясно структурирана. Хетерохроматинът е разделен на факултативен (може да премине от активна форма в плътна неактивна, в зависимост от етапа на жизнения цикъл на клетката и необходимостта от внедряване на определени гени) и конститутивен (постоянно уплътнен). По време на митотично или мейотично делене целият хроматин е неактивен.
Конститутивният хетерохроматин се намира близо до центромерите и в крайните области на хромозомата. Резултатите от електронната микроскопия показват, че такъв хроматин запазва висока степен на кондензация не само на етапа на клетъчно делене, но и по време на интерфазата.
Биологична роля на хроматина
Основната функция на хроматина е да опакова плътно големи количества генетичен материал. Обаче простото поставяне на ДНК в ядрото не е достатъчно, за да функционира клетката. Необходимо е тези молекули да „работят” правилно, т.е. да могат да предават съдържащата се в тях информация чрез системата ДНК-РНК-протеин. Освен това клетката трябва да разпредели генетичен материал по време на деленето.
Структурата на хроматина напълно отговаря на тези задачи. Протеиновата част съдържа всички необходими ензими, а структурните характеристики им позволяват да взаимодействат с определени участъци от ДНК. Следователно втората важна функция на хроматина е да осигури всички процеси, свързани с изпълнението на ядрения геном.
В еукариотния геном се разграничават следните фракции.
1. Уникален, т.е. последователности, представени в едно копие или в няколко копия. Като правило това са цистрони - структурни гени, кодиращи протеини.
2. Нискочестотни повторения - поредици, повтарящи се десетки пъти.
3. Междинни или средночестотни повторения - последователности, повтарящи се стотици и хиляди пъти. Те включват рРНК гени (при човека има 200 на хаплоиден набор, при мишки - 100, при котки - 1000, при риби и цъфтящи растения - хиляди), тРНК, гени за рибозомни протеини и хистонови протеини.
4. Високочестотни повторения, чийто брой достига до 10 милиона (на геном). ДНК на мишки се състои от 70% уникални последователности, 20% от ниско- и средночестотни повторения и 10% от високочестотни повторения.
Повторенията образуват така наречените семейства, които се разбират като набор от последователности, които са напълно или предимно хомоложни една на друга.
Често, поради значителни разлики в нуклеотидния състав на високочестотните повторения и останалата част от ДНК, първите образуват, когато се центрофугират в градиент на плътност на цезиев хлорид, така наречените сателитни пикове, които имат по-висока или по-ниска плаваща плътност отколкото останалата част от ДНК. Тази част от генома е представена от малък (10...15) брой семейства от къси (5...12 bp) повторения, образуващи разширени блокове. В рамките на блокове, групи от повторения на отделни семейства могат да се редуват помежду си, така че сателитната ДНК има вид мозайка. Хибридизацията на фракции от високочестотни последователности с ДНК директно върху хромозомни препарати направи възможно да се установи, че тази фракция от генома е локализирана в региони на конститутивен хетерохроматин, най-често перицентромерен или теломерен. Още през 30-те години беше доказано, че генетично тези области са инертни, тоест не съдържат гени. В действителност такива малки последователности, които изграждат сателитна ДНК, не могат да кодират нищо друго освен олигопептиди. Освен това хетерохроматичните области не се транскрибират. По този начин, в случай на високочестотни ДНК последователности, се разкрива идентичността на молекулярната организация и генетичните свойства на еукариотната хромозомна ДНК. Трябва да се отбележи, че в по-голямата част от видовете тази фракция заема не повече от 10% от генома. Близките видове, като мишки и плъхове, имат напълно различни високочестотни последователности; при плъховете техният нуклеотиден състав не се различава от основната ДНК, докато геномът на мишката съдържа ясен богат на АТ сателит. Това означава, че високочестотната ДНК е способна на бързи промени по време на видообразуването.
Останалите 90% от еукариотния геном, неговата еухроматична част, е изградена на принципа на редуване (интерперсия) на уникални и повтарящи се последователности. Традиционно има два основни типа интерференции, наречени на вида, при който са описани за първи път: интерференции от типа „ксенопус“ (намиращи се в жабата с нокти Xenopus laevis)и тип Drosophila (описан за първи път при плодовата муха D. melanogaster). Приблизително 50% от генома Xenopus laevisуникални последователности от 800...1200 bp. редуват се с повтарящи се, чийто среден размер е 300 bp. В останалите геноми от типа “xenopus” разстоянията между съседните повторения значително надвишават 1...2 bp. Структурата на генома на ксенопус е широко разпространена, особено сред животните. Бозайниците и хората също принадлежат към този тип организация на генома. Характеристика на генома на хората и другите примати са разпръснати високочестотни повторения с дължина около 300 bp. При хората тези повторения съдържат място, отрязано от рестрикционния ензим Alu I. Броят на Alu-подобните повторения в човешкия геном достига 5 × 10 5, а според някои данни дори 10 6.
Alu-подобните последователности при примати са частични дупликации (удвоявания) на последователността B1 в генома на гризачите, описани за първи път от G. P. Georgiev и неговите колеги.
U D. melanogasterПараметрите на интерперсията се различават рязко от видовете с тип геном "xenopus": повтарящи се последователности с дължина 5600 bp. редуват се с уникални, чиято дължина е поне 13 000 bp.
Интересно е да се отбележи, че геномът на домашната муха е подреден според типа „ксенопус“. Този факт директно показва, че по време на еволюцията са възможни много бързи трансформации в характера на редуване на последователностите в еухроматичната част на генома. Птиците, по отношение на параметрите на смущението, заемат междинна позиция между типа „ксенопус“ и типа „дрозофила“. Както показват резултатите от скорошни проучвания, много видове животни и растения не могат да бъдат строго класифицирани в нито един тип въз основа на организацията на генома. Така в геномите на бозайниците има дълги повторения - няколко хиляди нуклеотидни двойки; в геномите на лилиите до 90% от ДНК може да бъде представена от повтарящи се последователности. Например, геномът на граховото зърно не съдържа уникални последователности, надвишаващи 300 bp по дължина.
Друга характеристика на повтарящите се последователности в еукариотните геноми са обърнатите повторения или палиндроми (вижте по-долу). При условия на ренатурация те почти моментално образуват дуплексни структури. По същество палиндромите са част от междинните повторения. Въпреки това, някои високочестотни повторения в еухроматичната част на генома, например членове на семейства Alu, могат да се появят както в директни, така и в обърнати позиции. Понякога други последователности се вмъкват между обърнатите повторения.
В живите организми молекулите на ДНК са или много дълги, или двуверижни молекули, затворени в пръстен, следователно всеки процес, свързан с трансфера на наследствена информация, трябва да се сблъска със сериозни топологични проблеми: появата на положително (+) или отрицателно (-) супернавиване на ДНК, образуването на катенани или възли.
Свръхнавитата ДНК има значителен енергиен резерв в сравнение със своята спокойна форма. Следователно, локалното размотаване на двойната спирала на ДНК с отрицателни суперспирали ще доведе до освобождаване на суперспиралното напрежение и следователно е енергийно благоприятно. Това е ясно очевидно във факта, че отрицателното свръхнавиване значително стимулира прехода на ДНК от дясната B-форма към лявата Z-форма. Отрицателното супернавиване на ДНК улеснява свързването на протеини, които развиват нейната двойна спирала.
Решението на тези топологични проблеми е предоставено от ДНК топоизомерази --ензими, които променят топологията на ДНК (фиг. 49). Топоизомеразите отпускат суперспиралните ДНК молекули, облекчавайки вътрешното им напрежение чрез въвеждане на единични и двуверижни скъсвания, последвано от тяхното възстановяване чрез лигиране). Въз основа на техния механизъм на действие има два вида ДНК топоизомерази: I и II.
ДНК топоизомерази I са мономерни протеини, които отпускат ДНК без консумация на енергия чрез въвеждане на едноверижни прекъсвания. ДНК топоизомерази II функционират като димери (при еукариоти) и тетрамери (при прокариоти), извършвайки АТФ-зависимо разцепване на двете ДНК вериги, последвано от прехвърляне на верига през скъсването и нейното лигиране.
За въвеждане на едноверижно прекъсване в ДНК, всички ДНК топоизомерази използват тирозинов остатък, който извършва нуклеофилна атака върху фосфатната група на ДНК, за да образува фосфотирозин. В резултат на това ензимите са ковалентно свързани към 5" или 3" краищата на ДНК при едноверижно разкъсване.
Топоизомерази подтип 1-5"свързани основно с едноверижни региониДНК,
чрез разрушаването му с образуването на 5"-фосфодиестерна връзка с тирозин на активния център на ензима. Едноверижна ДНК (отстраняване на завъртане) или двойноверижна ДНК (образуване на възел или катенан) преминава през Ензимите от този тип премахват само отрицателно супернавиване.Характерно за прокариотите.
Топоизомерази подтип 1-3"контакт двойноверижна ДНК,прекъсване на една верига с образуването на 3"-фосфодиестерна връзка с тирозин на активния център на ензима. Втората верига на дуплекса преминава през прекъсването, намалявайки плътността на супернавиването на ДНК; знакът на супернавиването не играе важна роля роля.Характерни за еукариотите.
Тип II топоизомеразисе свързват с двойноверижна ДНК и разкъсват двете вериги, за да образуват две 5" фосфодиестерни връзки с тирозините на активния център. Втората двойноверижна ДНК преминава в получената празнина и резултатът е промяна в броя на положителните или отрицателните суперзавъртания с 2 (за разлика от ензимите от тип I, които променят броя на суперзавъртанията на единица на стъпка).
Този ензим е способен да свързва, деканира и развързва непокътнати ДНК възли. За да се повтори цикълът много пъти, е необходим АТФ (фиг. 50).
Топоизомераза II E. coli(ДНК гираза) е ензим тип II, но не изисква АТФ. Той индуцира образуването на отрицателни суперспирали в отпуснатата кръгова ДНК. Гиразата взаимодейства с ДНК по такъв начин, че последната се увива около протеина. В този случай се получава положително супернавиване в онези места на ДНК молекулата, които са свързани с протеина. След това ензимът разкъсва двете ДНК вериги и прехвърля двойната верига отвътре навън, след което закрепва и двете скъсвания, превръщайки положителната верига в отрицателна (фиг. 51). Това е особено важно за инициирането на репликацията и също така е необходимо за нейното удължаване и прекратяване.
ДНК топоизомераза II е жизненоважен ензим във всеки еукариотен организъм. Ролята на ДНК топоизомеразата в образуването на по-високи нива на хроматинова структура е изяснена, а именно участието на ензима в образуването на хроматинови бримки по време на хромозомна кондензация.
Хистоните съставляват по-голямата част от основните хроматинови протеини и се намират в приблизително същото количество като ДНК. Въз основа на относителното съотношение на всеки тип основна аминокиселина, изразено като съотношение лизин/аргинин, петте вида хистони първо бяха характеризирани. Следа от тази класификация все още остава в имената на хистоните. Почти всички еукариоти съдържат едни и същи класове хистони. Техните свойства са обобщени в табл. 29.1.
Хистоните от четири класа директно взаимодействат с ДНК и образуват серия от частици от първо ниво на организация в хроматина. Запазването на типовете хистони по време на еволюцията може да се обясни с необходимостта да се запази тази основна реакция. Петият клас хистони участва във взаимодействията между частиците. Постоянството на класовете хистон предполага, че взаимодействията ДНК-хистон, хистон-хистон и хистон-нехистонов протеин могат да бъдат до голяма степен сходни при различните видове. Оттук можем да направим заключение за общите механизми на образуване както на първичните частици, така и на последващите структури от по-сложен ред, състоящи се от поредица от частици.
Хистоните от първите четири класа имат значително количество както киселинни, така и основни аминокиселини. Следователно тези протеини носят висок заряд. Съотношението на основните към киселинните аминокиселини е от порядъка на 1,4-2,5. Тези хистони са разделени на две групи.
Богатите на аргинин хистони включват два типа: H3 и H4. Те са сред най-запазените от всички известни протеини. Аминокиселинните последователности на тези протеини са идентични дори при толкова далечни видове като крава и грах. Само редки аминокиселинни замествания са открити в хистони H3 и H4 на други видове. Запазването на цялата последователност предполага, че всички нейни аминокиселини са от съществено значение за функцията на протеина. Логично, тази функция трябва да бъде една и съща в огромното мнозинство от различни видове, подкрепяйки концепцията за обща основа за структурата на хроматина.
Хистоните, умерено обогатени с лизин, включват два протеина. Те се наричат H2A и H2B (противно на номенклатурното им обозначение, това не са свързани, а независими протеини). Същите два вида хистони се срещат в различни еукариоти, но те показват подчертани междувидови вариации в аминокиселинната последователност.
Петият клас е представен от хистони, които са много богати на лизин; той се състои от няколко доста тясно свързани протеини с припокриващи се аминокиселинни последователности. Това са хистон H1 (в червените кръвни клетки на птиците има вариант, наречен H5). В тези хистони са открити значителни междувидови и междутъканни вариации (дрождите очевидно нямат този клас хистони). Въпреки че тези хистони са най-основните хистони, те могат лесно да бъдат изолирани от хроматина чрез пълно разтваряне във физиологичен разтвор (0,5 М).
Както подсказва името, нехистоните са всички други хроматинови протеини. Поради това се предполага, че те имат големи видови и тъканни различия, въпреки че все още няма точни данни за степента на тяхното разнообразие. Тези протеини съставляват по-малка част от общата маса на хроматиновите протеини, отколкото хистоните. В допълнение, това включва много по-голям брой протеини, така че всеки отделен протеин присъства в много по-малки количества от всеки отделен хистон.
Класът на нехистонови протеини може да включва протеини, свързани с генна експресия и протеини, участващи в организацията на структури от по-висок ред. Така сред най-известните нехистони е РНК полимеразата. HMG протеините (група с висока подвижност) представляват отделен, ясно различим подклас на нехистони. Основният проблем, който възниква при работа с други нехистонови протеини, е тяхното замърсяване с други ядрени протеини
Хистоните се отстраняват чрез конкурентно заместване с полианиони декстран сулфат и хепарин.
Нуклеозоми
Ако интерфазните ядра се суспендират в разтвор с ниска йонна сила, те ще набъбнат и хроматиновите нишки ще се освободят от тях в местата на прекъсване. На фиг. Фигура 29.1 показва лизирано ядро, от което излизат нишки. На някои места хроматиновите нишки са съставени от плътно опакован материал, но на места, където са удължени, може да се види, че са съставени от отделни частици. Тези частици се наричат нуклеозоми. В особено удължени участъци ясно се вижда, че отделните нуклеозоми са свързани с тънка нишка - това е свободна двойноверижна ДНК. По този начин непрекъснатата двойноверижна ДНК преминава през поредица от частици.
Индивидуални нуклеозоми могат да бъдат получени чрез третиране на хроматин с ензима микрококова нуклеаза. Това е ендонуклеаза, която разрязва ДНК веригата в кръстовищата между нуклеозомите. Първо се освобождават групи от частици, а след това отделни нуклеозоми. Мономерните нуклеозоми са ясно видими на фиг. 29.2 под формата на компактни частици (чиято реална форма е подобна на диск; виж по-долу). Те се утаяват при приблизително 11S, което съответства на обща маса в диапазона от 250 000-300 000 далтона. Съотношението протеин/ДНК е около 1,25. Димери, тримери и др. имат подходящи свойства, когато се анализират биохимично или се наблюдават под електронен микроскоп.
Мономерните нуклеозоми съдържат ДНК (~200 bp), свързана с хистонов октамер. Този октамер съдържа хистони H2A, H2B, NZ и H4 - по две копия от всеки. Те понякога се наричат хистоново ядро (хистоново ядро). Такива комплекси са показани схематично на фиг. 29.3.
Нуклеозомата е протеинов комплекс, състоящ се от хистони.
Характеристики на нуклеозома
ДНК в B-формата е усукана с 0,25-0,35 bp на завъртане на спиралата, докато стъпката на спиралата е 10,2 bp/завъртане (за B-формата в разтвор е 10,5 bp/завъртане). Тази ДНК прави 1,75 завъртания наляво около нуклеозомата. Комплексът не се унищожава, когато хистоновите рамена са унищожени. N-терминалните домени на H3 контактуват с ДНК на входа и изхода от сърцевинната частица, H4 се свързва с вътрешната част на ДНК на нуклеозомата H1 е линкерен хистон и изпълнява функцията на свързване на нуклеозомите една с друга, но , H1 не се намира в дрождите и неговият аналог Hho1p не изпълнява видима роля в сгъването на ДНК и взаимодействието на нуклеозомите една с друга.
Всяко допълнително увеличение на протеиновото съдържание зависи от наличието на малки количества нехистонови протеини, които се свързват с нуклеозомите.
Нуклеозомната ДНК може да бъде разделена на две части.
ДНК на минимална нуклеозома има постоянна дължина от 146 bp. и е относително устойчив на нуклеазна деградация. (Други нуклеази, включително микрококова нуклеаза, спират преди този участък от ДНК.)
Линкерната ДНК съдържа остатъка от повтарящата се единица. Неговата дължина може да варира in vivo от 8 bp до 114 bp на нуклеозома.
Като се има предвид моделът, показан на фиг. На Фигура 29.8 като напречно сечение можете да видите, че двете навивки на ДНК са близо една до друга. Това може да има функционално обяснение. Едно завъртане около нуклеозома покрива 80 bp, така че точките, разположени на това разстояние в свободна двойна спирала, могат да бъдат разположени доста близо една до друга върху нуклеозомата. По този начин, ако ДНК-свързващ протеин се свърже едновременно с две завъртания на ДНК, както е показано на фиг. 29.9, последователностите, които той разпознава, могат да бъдат разположени много по-далеч в двойната спирала на ДНК от размера на областта, която ги свързва в протеина. Често се обсъжда дали началната точка на транскрипция може да бъде разположена близо до позиция -80, така че и двете вериги да са едновременно в контакт с РНК полимеразата. (Това ще добави конкретни детайли към обобщения модел, показан на Фигура 11.8.)
Плътността на опаковане на отделна нуклеозома е приблизително 6 (тъй като 67 nm ДНК е опакована в частица с дължина около 11 nm). Възможно е да се опаковат серия от нуклеозоми достатъчно плътно, за да се поддържа това съотношение. Много работа по изследването на нуклеозомни масиви е извършена върху вируса SV40.
Важен параметър при описването на структурата на хроматина е степента на свръхнавиване, която може да възникне на няколко нива:
свръхнавиването може да е резултат от опаковане на ДНК върху нуклеозома.
свръхнавиването може да е резултат от подреждането на нуклеозоми в структура от по-високо ниво.
Състоянието на свръхнавиване може до голяма степен да се поддържа от протеини (съгласно принципа, описан в Глава 28). Директните измервания на плътността на супернавиването ще разкрият средното напрежение на усукване на ДНК в резултат на образуването на свободни супернавивки, но това няма да разкрие супернавиването, което се задържа по време на опаковането на ДНК.
За мини-хромозомата на вируса SV40 степента на супернавиване в самата нуклеозома може да бъде директно измерена. Една мини-хромозома може да има свободни суперспирали в гирлянда от нуклеозоми, както и суперспирали, държани върху нуклеозома. Процедурата за измерване на супернавиване, базирана само на нуклеозомна структура, е показана на фиг. 29.10. Първо се освобождават свободните супернавивки на самата минихромозома, така че гирляндът от нуклеозоми образува пръстен с нулево супернавиване. След това хистоновите октамери се екстрахират. В резултат на тази процедура освободената ДНК се разпространява свободно. По този начин всеки суперзавой, който се съдържа в мини-хромозомата, ще се появи в депротеинизираната ДНК като -- 1 завой. Това може да измери общия брой суперзавъртания в ДНК на вируса SV40.
Организация на нуклеозомите (хистони) и ДНК
Досега разглеждахме нуклеозомния дизайн от гледна точка на това как повтарящите се единици на ДНК са организирани на повърхността на нуклеозомите.
как хистоните взаимодействат помежду си и с ДНК. Дали хистоните взаимодействат само в присъствието на ДНК или са способни да се сглобяват независимо в октамери?
Все още има много неща, които не знаем за структурата на отделните хистони в нуклеозомата, но тяхната относителна локализация вече е започнала да става ясна. Повечето от данните за хистоновите взаимодействия са получени чрез изследване на способността за агрегиране и образуване на кръстосани връзки в нуклеозомата.
Способността на хистоните да се агрегират един с друг е добре проучена. Богатите на аргинин хистони могат да бъдат получени като ясно видим тетрамер (H3 2 H4 2). Хистоните, умерено богати на лизин, образуват продукт, който е по-слабо характеризиран, но който очевидно образува димер (H2A * H2B), който има тенденция към по-нататъшно агрегиране. Една от формите на получения агрегат може да бъде тетрамер (H2A 2 * H2B 2). Тези два тетрамера се наричат хомотипични (името отразява факта, че всеки от тях съдържа само хистони, принадлежащи към един от първоначалните класове).
Непокътнати хистонови октамери могат да бъдат получени или чрез екстракция на хроматин, или (с голяма трудност) чрез комбиниране на хистони in vitro при условия на висока концентрация на сол и протеин. Октамерът може да се дисоциира, за да образува хистонов хексамер и свободен H2A*H2B димер. В резултат на отделянето на втория димер H2A * H2B се образува тетрамерът H32H42. Всички тези форми могат да бъдат извлечени от хроматин. Въз основа на тези данни можем да заключим, че нуклеозомата има централно „ядро“, състоящо се от H3 2 H4 2 тетрамер, свързан с два независими H2A * H2B димера.
Кръстосаното свързване ни позволява да определим кои двойки хистони са по-близо една до друга в нуклеозомата. (Трудността при тълкуването на тези данни е, че само малка част от хистоните са омрежени. Следователно резултатите трябва да се оценяват с повишено внимание, като се има предвид типичният характер на повечето взаимодействия.) Въз основа на получените данни, модел на нуклеозомна организация е построена.
Сглобяване на нуклеозоми
1 начин. се дължи на способността на тетрамера H32H42 да организира ДНК в частици, които донякъде приличат на минимална нуклеозома (по отношение на тяхната чувствителност към микрококова нуклеаза). С добавянето на димера H2A * H2B, тези тела могат да бъдат превърнати в минимална нуклеозома. Тук възниква идеята, че в структурата на нуклеозомата има „ядро“ от богати на аргинин хистони. Възможно е този път да се използва in vivo, тъй като е в съответствие с наблюдението, че хистоните H3 и H4 са включени в репликиращия се хроматин, преди хистоните H2A и H2B да бъдат включени в него.
2. метод. Данните са получени с помощта на омрежени хистонови октамери, които не могат да се дисоциират на отделни протеини, но въпреки това запазват способността да свързват ДНК, за да образуват минимална нуклеозома. Това предполага, че по принцип ДНК може да се увие около предварително образуван октамер.
От яйцеклетки Ксенопусизолиран протеин на сглобяване.
Това е пентамер, съдържащ идентични субединици от 29 000 далтона.
Това е протеин, който преобладава в ооцитите и е локализиран в нуклеоплазмата.
Антителата, създадени срещу този протеин, реагират с нуклеоплазмените протеини на много еукариоти. Следователно може да се приеме, че този протеин отговаря еволюционно на някаква универсална функция, фиксирана в процеса на еволюцията. Беше наречен нуклеоплазмин.
В присъствието на нуклеоплазмин хистоните могат да се свържат с ДНК, образувайки частици при физиологични условия (ниска концентрация на сол).
Но нуклеоплазминът сам по себе си не е достатъчен за образуване на нуклеозоми на определено разстояние.
Каква е функцията на нуклеоплазмина?
Това е кисел протеин, който не се свързва нито със свободна ДНК, нито с непокътнати нуклеозоми, но се свързва с всички отделни хистони
Реакцията се насища на ниво, равно на един нуклеоплазминов пентамер на хистонов октамер.
Нуклеоплазминът може да служи като "молекулен шаперон", свързвайки се с хистони и прехвърляйки ги към ДНК по по-регулиран начин, отколкото би било възможно без такъв конкурент. Тези. контролира афинитета на хистоните към ДНК. Това предположение се подкрепя от факта, че киселата полиглутаминова киселина, както и РНК, могат да действат по подобен начин като фактори на сглобяване.
Поетапност. Терминът „фазиране“ се отнася до неслучайното подреждане на нуклеозомите по отношение на специфична последователност от ДНК нуклеотиди в определени региони на генома. Позиционирането става, наред с други неща, с помощта на специални ДНК последователности, които имат свойството, че са по-податливи на огъване на двойната спирала на ДНК на това място. Преди генното активиране, нуклеозомите присъстват както в регулаторните последователности на ДНК нагоре по веригата, така и в самия промотор. По време на индуцирането на транскрипция на такъв ген, регулаторните фактори (TFs, които се свързват с TATA кутията), свързвайки се с ДНК, причиняват пряко или косвено разрушаване на нуклеозомната структура на съответните ДНК участъци.
Има региони, където няма нуклеозоми. Такива региони могат да бъдат свързани с контрола на генната експресия или с образуването на структури на по-високо ниво на организация на хроматина (Левин).
Нуклеозоми по време на репликация и транскрипция
Електронно микроскопско изследване на репликиращ се хроматин разкри, че и двете новообразувани фибрили съдържат нуклеозоми. Ако вземем предвид скоростта на синтеза на ДНК в еукариотите (20 nm / s), тогава новите нуклеозоми по време на удвояването на хромозомните фибрили трябва да се появят със скорост от 3-4 s. Такава висока скорост на образуване на нуклеозоми се дължи на факта, че по време на синтеза на ДНК вече има набор от синтезирани хистони от всички класове, готови да станат част от нуклеозомите. Хистоновите гени, които принадлежат към фракцията на умерено повтарящи се ДНК последователности, са представени като множество копия за всеки хистон. Те се активират заедно с началото на синтеза на ДНК, така че с напредването на вилицата на репликация новите участъци от ДНК могат незабавно да взаимодействат с новосинтезирани хистони. Новосинтезирани хистони и стари хистони в рамките на предходните нуклеозоми не се смесват по време на образуването на нуклеозоми по време на репликацията на ДНК. Вместо това, хистоновите октамери, присъстващи преди репликацията, остават непокътнати и се прехвърлят към дъщерния ДНК дуплекс, докато новите хистони се сглобяват в напълно нови сърцевини на свободни от нуклеозоми ДНК региони. Старите и новите хистонови октамери се разпределят на случаен принцип между дъщерни ДНК дуплекси.
Какво се случва със старите нуклеозоми във вилицата за репликация на ДНК не е напълно ясно. Според една хипотеза всяка от нуклеозомите, когато вилицата за репликация се приближи до нея, се разделя на две „полунуклеозоми“ и нуклеозомната ДНК се разгръща, за да позволи на ДНК полимеразата да премине през тази секция. След това новосинтезираната ДНК верига се свързва със свободни хистони, които са в изобилие в ядрото, и върху втората ДНК верига се образуват нови нуклеозоми.
Както вече беше споменато, активно функциониращите зони на хроматина се характеризират с декондензирано, дифузно състояние. Един от методите за получаване на фракции от активен хроматин се основава на това свойство на хроматина, когато чрез центрофугиране е възможно да се утаи кондензиран хроматин от ядрени хомогенати, като по този начин се отделя от дифузния хроматин, който има висока транскрипционна активност. Активните хроматинови фракции имат редица характерни свойства: повишена чувствителност към нуклеази, повишени нива на модификация на хистони (особено ацетилиране на хистон HI), повишено съдържание на някои нехистонови протеини.
Биохимичните доказателства показват, че по време на транскрипция, част от нуклеозомните протеини остават свързани с ДНК. Нуклеозомите като частици се виждат върху хроматиновите фибрили както преди мястото на освобождаване на транскрипта, така и след него с рядко кацане на РНК полимераза - ензим, два пъти по-голям от нуклеозома. Когато този ензим участва често (например по време на транскрипцията на рибозомни гени или гени в други активни локуси), частиците на РНК полимеразата са разположени близо една до друга и нуклеозомите между тях не се виждат (виж фиг. 101). Най-вероятно нуклеозомните протеини не губят връзката си с ДНК по време на преминаването на РНК полимераза, а самата ДНК се разгръща като част от нуклеозомата. Предложени са два варианта за промяна на структурата на нуклеозомите по време на синтеза на РНК. В една от тях нуклеозомата се "разцепва" на две полунуклеозоми и ДНК се разгръща; в другата, нуклеозомата, частично декомпактирана, задържа тетрамера (H3-H4) 2 и два димера H2A-H2B временно напускат и след това, след преминаване през РНК полимераза, се връщат и оригиналната нуклеозома се възстановява.
Второто ниво на уплътняване на ДНК е фибрила с диаметър 30 nm
По този начин, първото, нуклеозомно, ниво на уплътняване на хроматина играе както регулаторна, така и структурна роля, осигурявайки плътност на опаковката на ДНК приблизително 6-7 пъти.
Много изследвания с електронен микроскоп обаче показват, че хроматиновите фибрили с диаметър 30 nm се откриват както в митотичните хромозоми, така и в интерфазните ядра (фиг. 57, Vи 62). Хроматиновите фибрили с този диаметър се виждат както на ултратънки срезове след фиксиране с глутаралдехид, така и на препарати от изолиран хроматин и изолирани хромозоми в разтвори, съдържащи поне ниски концентрации на двувалентни катиони. Показано е, че хроматинова фибрила с диаметър 30 nm може обратимо да промени своя диаметър: тя се превръща във фибрила с дебелина 10 nm, ако хроматиновите препарати се прехвърлят в дейонизирана вода или в разтвори, съдържащи EDTA хелатон. В същото време, дори частична екстракция на хистон H1 трансформира първоначалните хроматинови фибрили (30 nm) във влакна с диаметър 10 nm, които имат типично нуклеозомно ниво на организация. Когато към тях се добави хистон Н1, първоначалният диаметър на фибрилите се възстановява.
Всичко това показва, че нуклеозомните вериги на хроматина са подредени по някакъв специфичен начин, така че не се получава хаотично струпване на нуклеозоми, а правилна нишковидна структура с диаметър 30 nm.
Има най-малко две гледни точки относно естеството на нуклеозомното опаковане в рамките на хроматинова фибрила с диаметър 30 nm. Един от тях защитава така наречения соленоиден тип опаковане на нуклеозоми. Съгласно този модел, нишка от плътно опаковани нуклеозоми с диаметър 10 nm образува на свой ред спирални завои със спирална стъпка от около 10 nm. Има шест нуклеозоми на завъртане на такава суперспирала (виж Фиг. 62). В резултат на такова опаковане се появява спираловиден тип фибрил с централна кухина, който понякога се вижда на негативно оцветени препарати като тесен „канал“ в центъра на фибрила. Когато такава фибрила е частично разгъната, декомпактирана и нанесена върху субстрат, „зигзагообразното“ подреждане на нуклеозомите по дължината на фибрилата е ясно видимо. Смята се, че хистонът HI осигурява взаимодействие между съседни нуклеозоми, като не само ги приближава и свързва една с друга, но също така насърчава образуването на кооперативна връзка между нуклеозомите, което води до образуването на доста плътна фибрилна спирала с диаметър от 10 nm. Отстраняването, дори частично, на хистон HI предизвиква прехода на фибрил с диаметър 30 nm във фибрил с диаметър 10 nm, а при пълното му отстраняване последният се разгръща в структура тип „мъниста на струна“. Този соленоидален тип опаковане на ДНК води до плътност на опаковане от приблизително 40 (т.е. има 40 μm ДНК на микрометър от веригата). Тези идеи бяха потвърдени чрез анализиране на структурата на хроматина с помощта на рентгенова и неутронна дифракция. Тук трябва да се отбележи, че идеята за соленоидния тип сгъване е получена от анализа на вторично кондензиран хроматин. Първо, хроматиновите препарати се приготвят в присъствието на EDTA или се изолират в разтвори с ниска йонна сила в присъствието на магнезиеви йони. Във всички тези случаи хроматинът първоначално се декондензира до ниво „мъниста на низ“, където контактът между нуклеозомите липсва или е дестабилизиран.
Ако изследваме хроматина като част от ядрата или под формата на изолирани препарати, но при поддържане на определена концентрация на двувалентни катиони (не по-ниска от 1 mM), тогава можем да видим дискретност в състава на хроматиновите фибрили с диаметър 30 nm. : състои се, така да се каже, от плътно разположени глобули с еднакъв размер - от нуклеомери. В чуждестранната литература такива 30-нанометрови глобули или нуклеомери се наричат суперперли („суперперли“) (виж Фиг. 57, c и 62). Установено е, че ако при условия, при които се запазва нуклеомерната структура на хроматиновите фибрили, хроматиновите препарати се подлагат на нуклеазна обработка, тогава част от хроматина се разтваря. В този случай в разтвора влизат частици с размер около 30 nm, с коефициент на утаяване, равен на 45S в разтвори, съдържащи 1 mM магнезий. Ако такива изолирани нуклеомери се третират с EDTA и магнезиевите йони се отстранят, те се разгръщат в нуклеозомни вериги, съдържащи 6-8 нуклеозоми. Така един нуклеомер съдържа ДНК сегмент, съответстващ на 1600 базови двойки или 8 нуклеозоми.
Компактността на нуклеомера зависи от концентрацията на магнезиеви йони и наличието на хистон HI. Нехистоновите протеини не участват в конформационни трансформации на нуклеомери.
И така, основният хроматинов фибрил с диаметър 30 nm е линейно редуване на нуклеомери по протежение на уплътнена ДНК молекула (виж Фиг. 62). Вероятно хистоните HI, намиращи се в централната зона на тази голяма частица и взаимодействайки помежду си, поддържат нейната цялост. Това се подкрепя от данни за кооперативното свързване на хистон HI в група от 6-8 молекули.
Противоречието между соленоидните и нуклеомерните модели на опаковане на нуклеозоми в състава на хроматиновите фибрили може да бъде премахнато, ако приемем неправилния соленоиден модел: броят на нуклеозомите на завъртане на спиралата не е строго постоянна стойност, което може да доведе до редуване на региони с по-голям или по-малък брой нуклеозоми на ход.
Нуклеомерното ниво на пакетиране на хроматина осигурява 40-кратно уплътняване на ДНК, което е важно не само за постигане на целите за уплътняване на гигантски ДНК молекули. Уплътняването на ДНК в хроматиновите фибрили с диаметър 30 nm може да наложи допълнителни функционални ограничения. Така беше установено, че в състава на хроматинова фибрила с диаметър 30 nm ДНК става практически недостъпна за взаимодействие с ензим като ДНК метилаза. В допълнение, способността на хроматина да се свързва с РНК полимераза и редица регулаторни протеини рязко намалява. По този начин второто ниво на уплътняване на ДНК може да играе ролята на фактор, който инактивира гените.
В заключение е необходимо да се припомни още веднъж, че както нуклеозомните, така и нуклеомерните (супербид) нива на уплътняване на хроматинова ДНК се извършват благодарение на хистонови протеини, които участват не само в образуването на нуклеозоми, но и в тяхното кооперативно свързване в форма на DNP фибрили, където ДНК претърпява допълнително свръхнавиване. Всички други нива на уплътняване са свързани с по-нататъшното естество на опаковането на фибрили с диаметър 30 nm в нови нива на уплътняване, където нехистоновите протеини играят водеща роля.
Хроматинът е маса от генетична материя, състояща се от ДНК и протеини, които кондензират, за да образуват хромозоми по време на еукариотно делене. Хроматинът се намира в нашите клетки.
Основната функция на хроматина е да компресира ДНК в компактна единица, която е по-малко обемиста и може да влезе в ядрото. Хроматинът се състои от комплекси от малки протеини, известни като хистони и ДНК.
Хистоните помагат за организирането на ДНК в структури, наречени нуклеозоми, осигурявайки основата за обвиване на ДНК. Нуклеозомата се състои от последователност от ДНК вериги, които се увиват около набор от осем хистона, наречени октомери. Нуклеозомата допълнително се сгъва, за да образува хроматиново влакно. Хроматиновите влакна се навиват и кондензират, за да образуват хромозоми. Хроматинът позволява редица клетъчни процеси, включително репликация на ДНК, транскрипция, възстановяване на ДНК, генетична рекомбинация и клетъчно делене.
Еухроматин и хетерохроматин
Хроматинът в клетката може да бъде уплътнен в различна степен в зависимост от етапа на развитие на клетката. Хроматинът в ядрото се съдържа под формата на еухроматин или хетерохроматин. По време на интерфазата клетката не се дели, а претърпява период на растеж. По-голямата част от хроматина е в по-малко компактна форма, известна като еухроматин.
ДНК е изложена на еухроматин, което позволява настъпване на репликация и транскрипция на ДНК. По време на транскрипцията двойната спирала на ДНК се развива и отваря, така че протеините, кодиращи протеини, да могат да бъдат копирани. Репликацията и транскрипцията на ДНК са необходими на клетката, за да синтезира ДНК, протеини и в подготовка за клетъчно делене ( или ).
Малък процент от хроматина съществува като хетерохроматин по време на интерфазата. Този хроматин е плътно опакован, предотвратявайки генната транскрипция. Хетерохроматинът се оцветява с багрила, по-тъмни от еухроматина.
Хроматин в митоза:
Профаза
По време на профазата на митозата хроматиновите влакна се превръщат в хромозоми. Всяка репликирана хромозома се състои от две хроматиди, свързани заедно.
Метафаза
По време на метафазата хроматинът става изключително компресиран. Хромозомите са подредени върху метафазната плоча.
Анафаза
По време на анафазата сдвоените хромозоми () се разделят и издърпват от вретеновидни микротубули към противоположните полюси на клетката.
Телофаза
В телофазата всяка нова клетка се премества в собственото си ядро. Хроматиновите влакна се развиват и стават по-малко уплътнени. След цитокинезата се образуват две генетично идентични. Всяка клетка има еднакъв брой хромозоми. Хромозомите продължават да се развиват и удължават образуващия се хроматин.
Хроматин, хромозома и хроматид
Хората често имат проблеми с разграничаването на термините хроматин, хромозома и хроматид. Въпреки че и трите структури са направени от ДНК и се намират в ядрото, всяка се дефинира отделно.
Хроматинът се състои от ДНК и хистони, които са опаковани в тънки влакна. Тези хроматинови влакна не се кондензират, но могат да съществуват или в компактна форма (хетерохроматин), или в по-малко компактна форма (еухроматин). Процеси, включително репликация на ДНК, транскрипция и рекомбинация, протичат в еухроматина. Когато клетките се делят, хроматинът се кондензира, за да образува хромозоми.
Те са едноверижни структури от кондензиран хроматин. По време на процесите на клетъчно делене чрез митоза и мейоза, хромозомите се репликират, за да се гарантира, че всяка нова дъщерна клетка получава правилния брой хромозоми. Дублираната хромозома е двуверижна и има познатата форма X. Двете нишки са идентични и свързани в централна област, наречена центромер.
Това е една от двете вериги на репликирани хромозоми. Хроматидите, свързани с центромер, се наричат сестрински хроматиди. В края на клетъчното делене сестринските хроматиди се отделят от дъщерните хромозоми в новообразуваните дъщерни клетки.
Хроматин наречена сложна смес от вещества, от които са изградени еукариотните хромозоми. Основните компоненти на хроматина са ДНК, хистони и нехистонови протеини, които образуват силно подредени структури в пространството. Съотношението на ДНК и протеин в хроматина е ~ 1: 1, а по-голямата част от хроматиновия протеин е представен от хистони. Хистоните образуват семейство от силно запазени основни протеини, които са разделени на пет големи класа, наречени H1, H2A, H2B, H3 и H4. Размерът на хистоновите полипептидни вериги е в рамките на ~ 220 (H1) и 102 (H4)аминокиселинни остатъци. Хистон H1 е силно обогатен на остатъци Lys, хистоните H2A и H2B се характеризират с умерено съдържание на Lys, полипептидните вериги на хистоните H3 и H4 са богати Арг. Във всеки клас хистони (с изключение на H4), няколко подтипа на тези протеини се разграничават въз основа на аминокиселинни последователности. Тази множественост е особено характерна за H1 хистоните на бозайниците. В този случай има седем подтипа, наречени H1.1–H1.5, H1 o и H1t.
Ориз. I.2. Схематично представяне на нивото на бримковия домейн на уплътняване на хроматина
А– фиксиране на хромомерната бримка върху ядрената матрица с помощта на MAR/SAR последователности и протеини; b– „розетки“, образувани от бримка на хромометър; V– кондензация на розетни бримки с участието на нуклеозоми и нуклеомери
Важен резултат от взаимодействието на ДНК с протеините в хроматина е нейното уплътняване. Общата дължина на ДНК, съдържаща се в ядрото на човешките клетки, достига 1 m, докато средният диаметър на ядрото е 10 µm. Дължината на ДНК молекула, съдържаща се в една човешка хромозома, е средно ~ 4 см. В същото време дължината на метафазната хромозома е ~ 4 µm. Следователно, ДНК на човешките метафазни хромозоми е уплътнена по дължина най-малко 10 4 пъти. Степента на уплътняване на ДНК в интерфазните ядра е много по-ниска и неравномерна в отделните генетични локуси. От функционална гледна точка има еухроматин И хетерохроматин . Еухроматинът се характеризира с по-малко уплътняване на ДНК в сравнение с хетерохроматина и активно експресираните гени са локализирани главно в него. В момента има широко разпространено убеждение, че хетерохроматинът е генетично инертен. Тъй като истинските му функции не могат да се считат за установени днес, тази гледна точка може да се промени с натрупването на знания за хетерохроматина. В него вече се намират активно експресирани гени.
Хетерохроматизацията на определени хромозомни участъци често е придружена от потискане на транскрипцията на присъстващите в тях гени. Разширени участъци от хромозоми и дори цели хромозоми могат да бъдат включени в процеса на хетерохроматизация. Съответно, смята се, че регулирането на транскрипцията на еукариотния ген се извършва главно на две нива. В първия от тях уплътняването или декомпактизирането на ДНК в хроматина може да доведе до дългосрочно инактивиране или активиране на разширени участъци от хромозоми или дори цели хромозоми по време на онтогенезата на организма. По-фино регулиране на транскрипцията на активирани хромозомни региони се постига на второ ниво с участието на нехистонови протеини, включително множество транскрипционни фактори.
Структурна организация на хроматина и хромозомите в еукариотите.Въпросът за структурната организация на хроматина в интерфазните ядра в момента далеч не е разрешен. Това се дължи преди всичко на сложността и динамичността на нейната структура, която лесно се променя дори при незначителни външни влияния. Повечето от знанията за структурата на хроматина са получени in vitro върху препарати от фрагментиран хроматин, чиято структура се различава значително от тази в естествените ядра. В съответствие с общата гледна точка има три нива на структурна организация на хроматина в еукариотите: 1 ) нуклеозомна фибрила ; 2) соленоид , илинуклеомер ; 3) контурна домейн структура , включителнохромомери .
Нуклеозомни фибрили. При определени условия (при ниска йонна сила и в присъствието на двувалентни метални йони) е възможно да се наблюдават правилни структури в изолиран хроматин под формата на разширени фибрили с диаметър 10 nm, състоящи се от нуклеозоми. Тези фибриларни структури, в които нуклеозомите са подредени като мъниста на връв, се считат за най-ниското ниво на пакетиране на еукариотна ДНК в хроматина. Нуклеозомите, които изграждат фибрилите, са разположени повече или по-малко равномерно по дължината на ДНК молекулата на разстояние 10–20 nm една от друга. Нуклеозомите съдържат четири двойки хистонови молекули: H2a, H2b, H3 и H4, както и една хистонова молекула H1. Данните за структурата на нуклеозомите се получават основно чрез три метода: рентгенов дифракционен анализ с ниска и висока разделителна способност на нуклеозомни кристали, междумолекулни кръстосани връзки протеин-ДНК и разцепване на ДНК в нуклеозомите с помощта на нуклеази или хидроксилни радикали. Въз основа на тези данни А. Клуг конструира модел на нуклеозомата, според който ДНК (146 bp) в Б-образна форма(дясна спирала със стъпка 10 bp) се навива около хистонов октамер, в централната част на който са разположени хистони H3 и H4, а в периферията - H2a и H2b. Диаметърът на такъв нуклеозомен диск е 11 nm, а дебелината му е 5,5 nm. Структурата, състояща се от хистонов октамер и ДНК, навита около него, се нарича нуклеозомна кó ров частици.ДА СЕ ó частиците на рова са разделени една от друга чрез сегменти линкерна ДНК. Общата дължина на ДНК сегмента, включен в животинската нуклеозома, е 200 (15) bp.
Хистоновите полипептидни вериги съдържат няколко вида структурни домени. Централният глобуларен домен и гъвкавите изпъкнали N- и С-терминални области, обогатени с основни аминокиселини, се наричат рамене(ръка). С-терминални домени на полипептидни вериги, участващи във взаимодействията хистон-хистон в рамките на ó частиците са предимно под формата на -спирала с разширено централно спирално сечение, по което от двете страни е положена по една по-къса спирала. Всички известни места на обратими пост-транслационни модификации на хистони, които се появяват през целия клетъчен цикъл или по време на клетъчна диференциация, са локализирани в гъвкавите основни домени на техните полипептидни вериги (Таблица I.2). Освен това, N-терминалните рамена на хистоните H3 и H4 са най-запазените региони на молекулите и хистоните като цяло са едни от най-еволюционно запазените протеини. Използване на генетични изследвания на дрождите S. cerevisiae Установено е, че малки делеции и точкови мутации в N-терминалните части на хистоновите гени са придружени от дълбоки и разнообразни промени във фенотипа на дрождените клетки. Това показва изключителното значение на целостта на хистоновите молекули за осигуряване на правилното функциониране на еукариотните гени.
В разтвор хистоните H3 и H4 могат да съществуват под формата на стабилни тетрамери (H3) 2 (H4) 2, а хистоните H2A и H2B - под формата на стабилни димери. Постепенното увеличаване на йонната сила в разтвори, съдържащи естествен хроматин, води до освобождаване първо на H2A/H2B димери и след това на H3/H4 тетрамери.
По-нататъшно усъвършенстване на фината структура на нуклеозомите в кристалите беше извършено наскоро в работата на K. Lueger et al. (1997), използвайки рентгенов дифракционен анализ с висока разделителна способност. Установено е, че изпъкналата повърхност на всеки хистонов хетеродимер в октамера е заобиколена от ДНК сегменти с дължина 27–28 bp, разположени под ъгъл от 140° един спрямо друг, които са разделени от линкерни области с дължина 4 bp.
В съответствие със съвременните данни, пространствената структура на ДНК като част от ó ровите частици са малко по-различни от B-формата: двойната спирала на ДНК е усукана с 0,25–0,35 bp/завъртане на двойната спирала, което води до образуването на стъпка на спиралата, равна на 10,2 bp/завъртане (в B - форми в разтвор – 10,5 bp/оборот). Стабилност на хистоновия комплекс в състава на ó Образуването на частица се определя от взаимодействието на техните глобуларни части; следователно отстраняването на гъвкави рамена при условия на лека протеолиза не е придружено от разрушаване на комплекса. N-терминалните рамена на хистоните очевидно осигуряват тяхното взаимодействие със специфични ДНК региони. По този начин N-терминалните домени на хистон Н3 контактуват с ДНК региони на входа на ó първата частица и излиза от нея, докато съответният домен на хистон Н4 се свързва с вътрешната част на ДНК на нуклеозомата.
Изследванията на нуклеозомната структура с висока разделителна способност, споменати по-горе, показват, че централната част на 121-bp ДНК сегмент. в рамките на нуклеозомата образува допълнителни контакти с хистон Н3. В този случай N-терминалните части на полипептидните вериги на хистоните H3 и H2B преминават през каналите, образувани от малките жлебове на съседните ДНК суперспирали на нуклеозомата, а N-терминалната част на хистона H2A контактува с малката бразда на външната част на суперспиралата на ДНК. Взети заедно, данните с висока разделителна способност показват, че ДНК в сърцевината на нуклеозомите се огъва неравномерно около хистоновите октамери. Кривината се нарушава на местата, където ДНК взаимодейства с повърхността на хистона, и такива прекъсвания са най-забележими на разстояния от 10–15 и 40 bp. от центъра на суперспиралата на ДНК.
