При изучаване на ретровируси, чийто геном е представен от едноверижни РНК молекули, беше открито, че по време на вътреклетъчното развитие те преминават през етапа на интегриране на своя геном под формата на двойноверижна ДНК в хромозомите на клетката гостоприемник. През 1964 г. X. Temin изказва хипотеза за съществуването на специфичен за вируса ензим, способен да синтезира комплементарна ДНК върху матрица на РНК. През 1970 г. X. Temin и S. Mizutani, както и независимо от тях D. Baltimore, откриват такъв ензим в препарат от извънклетъчни вириони на вируса на саркома на Rous. Тази РНК-зависима ДНК полимераза се нарича ревертаза (обратна транскриптаза).
Ревертазата от птичи ретровируси е изследвана най-подробно. Всеки вирион съдържа около 50 молекули от този ензим. Обратната транскриптаза се състои от две субединици - ά (65 kDa) и β (95 kDa), присъстващи в еквимоларни количества. ά-субединица е N-терминалната част (две трети) на β-субединица.
Обратната транскриптаза има поне три ензимни активности:
· ДНК полимераза, която използва както РНК, така и ДНК като матрица;
· активността на РНКаза Н, която хидролизира РНК като част от РНК-ДНК хибрид, но не и едно- или двуверижна РНК;
· ДНК ендонуклеаза.
Първите две дейности са необходими за синтеза на вирусна ДНК и ендонуклеазата изглежда важна за интегрирането на вирусна ДНК в генома на клетката гостоприемник. β-субединицата на ревертазата има и трите активности, докато ά-субединицата има само полимераза и РНКаза Н.
Пречистената обратна транскриптаза синтезира ДНК както от РНК, така и от ДНК матрици. За да започне синтеза, реверсетазата, подобно на други полимерази, изисква къса двойноверижна област - праймер. Праймерът може да бъде едноверижен сегмент от РНК и ДНК, които по време на реакцията стават ковалентно свързани с новосинтезираната ДНК верига.
Обратната транскриптаза се използва предимно за транскрибиране на информационна РНК в комплементарна ДНК (cDNA). Реакцията на обратна транскрипция се извършва в присъствието на силни инхибитори на РНКазната активност. В този случай е възможно да се получат пълноразмерни ДНК копия на целевите РНК молекули. Oligo(dT) се използва като праймер за обратна транскрипция на поли(А)-съдържащи иРНК (фиг.), а за РНК молекули, които нямат 3" поли(А) краища, химически синтезирани олигонуклеотиди, комплементарни на 3" края изследваната РНК. В допълнение, последният тип РНК молекули могат да бъдат превърнати в поли(А)-съдържащи с помощта на Е. coli поли(А) полимераза.
След синтеза на комплементарна ДНК верига върху иРНК и разрушаване на РНК (обикновено се използва алкална обработка), се извършва синтеза на втората ДНК верига. В този случай се използва способността на обратното движение да образува самодопълващи се фиби в 3" краищата на едноверижни сДНК, които могат да служат като праймер. Шаблонът е първата верига на сДНК. Тази реакция може да се катализира от както reversease, така и E. coli ДНК полимераза I. Комбинацията от тези два ензима позволява увеличаване на добива на пълни двойноверижни cDNA молекули.
В края на синтеза, първата и втората верига на кДНК остават ковалентно свързани чрез бримката на фиби, която служи като праймер по време на синтеза на втората верига. Тази верига се разцепва от ендонуклеаза S1, която специфично разрушава едноверижни региони нуклеинова киселина. Краищата, образувани в този случай, не винаги са тъпи и за да се повиши ефективността на последващото клониране, те се поправят до тъпи с помощта на фрагмента Klenow на E. coli ДНК полимераза I. Получената двойноверижна кДНК след това може да бъде вмъкната в клониращи вектори, размножена като част от хибридни ДНК молекули и използвана за по-нататъшни изследвания.
Обратна транскриптаза (обратна или РНК-зависима ДНК полимераза) е ензим, който катализира синтеза на ДНК върху РНК шаблон в процес, наречен „ обратна транскрипция”. Името на процеса отразява обратното на процеса транскрипции, извършва се в другата посока: РНК транскрипт се синтезира от ДНК шаблонна молекула.
Тези ензими са изолирани от РНК вируси ( ретровируси). Обратната транскриптаза се използва от туморни вируси за транскрибиране на иРНК в комплементарната верига на ДНК. При изучаване на ретровируси, чийто геном е представен от едноверижни РНК молекули, беше открито, че по време на вътреклетъчното развитие ретровирусът преминава през етапа на интегриране на своя геном под формата на двойноверижна ДНК в хромозомите на гостоприемника клетка. През 1964 г. Temin изказва хипотезата за съществуването на специфичен за вируса ензим, способен да синтезира комплементарна ДНК върху РНК матрица. Усилията, насочени към изолиране на такъв ензим, бяха увенчани с успех и през 1970 г. Temin и Mizutani, както и независимо Балтимор откриха желания ензим в препарат от извънклетъчни вириони на вируса на саркома на Rous. Тази РНК-зависима ДНК полимераза се нарича обратна транскриптаза или ревертаза.
Ревертазата от птичи ретровируси е изследвана най-подробно. Всеки вирион съдържа около 50 молекули от този ензим. Обратната транскриптаза се състои от две субединици - a (65 kDa) и b (95 kDa), присъстващи в еквимоларни количества. Обратната транскриптаза има поне три ензимни активности:
1) ДНК полимераза, която използва както РНК, така и ДНК като матрица;
2) активността на РНКаза Н, която хидролизира РНК като част от РНК-ДНК хибрид;
3) ДНК ендонуклеазна активност.
Първите две дейности са необходими за синтеза на вирусна ДНК и ендонуклеазата изглежда важна за интегрирането на вирусна ДНК в генома на клетката гостоприемник. Пречистената обратна транскриптаза синтезира ДНК както върху РНК, така и върху ДНК матрици (фиг. 11).
Ориз. 11. Схема за синтез на двойноверижни ДНК копия на РНК молекули
За да започне синтеза, реверсетазата, подобно на други полимерази, изисква къса двойноверижна област (праймер). Праймерът може да бъде едноверижен сегмент от РНК и ДНК, които по време на реакцията стават ковалентно свързани с новосинтезираната ДНК верига. В генното инженерство се използват както олиго-(dT) праймери, комплементарни на 3"-polyA краищата на иРНК, така и набор от хексануклеотиди, „произволни“ по състав и последователност (случайни праймери). Често за РНК молекули с известен първичен последователности, които нямат 3"- поли(А) краища, използват химически синтезирани олигонуклеотиди, комплементарни на 3" края
Обратната транскриптаза се използва предимно за транскрибиране на информационна РНК в комплементарна ДНК (cDNA). Реакцията на обратна транскрипция се провежда при специално подбрани условия, като се използват силни инхибитори на РНКазната активност. В този случай е възможно да се получат пълноразмерни ДНК копия на целевите РНК молекули. След синтеза на комплементарна ДНК верига върху иРНК и разрушаване на РНК (обикновено се използва алкална обработка), се извършва синтеза на втората ДНК верига. В този случай се използва способността на реверсетазата да образува самодопълващи се фиби в 3" краищата на едноверижни сДНК, които могат да служат като праймер.
Шаблонът е първата верига на cDNA. Тази реакция може да се катализира или от обратна реакция, или от ДНК полимераза I на Е. coli. Доказано е, че комбинацията от тези два ензима прави възможно увеличаването на добива на пълни двойноверижни cDNA молекули. В края на синтеза, първата и втората верига на кДНК остават ковалентно свързани чрез бримката на фиби, която служи като праймер по време на синтеза на втората верига. Тази верига се разцепва от ендонуклеаза S1, която специфично разрушава едноверижни участъци от нуклеинови киселини. Краищата, образувани в този случай, не винаги са тъпи и за да се повиши ефективността на последващото клониране, те се поправят до тъпи с помощта на фрагмента Klenow на E. coli ДНК полимераза I. Получената двойноверижна кДНК след това може да бъде вмъкната в клониращи вектори, размножена като част от хибридни ДНК молекули и използвана за по-нататъшни изследвания.
Ревертазата е ензим, който синтезира сДНК върху РНК матрица.
За някои вируси геномът не е ДНК, както обикновено, а РНК. Такива вируси бяха наречени ретровируси (ретро - обратно). През 1970 г. Д. Балтимор и Х. М. Темин откриват механизма на трансфер на информация от вирусна РНК към ДНК, т.е. обратното на това, което се случва в клетките на висшите организми. Този процес се нарича обратна транскрипция, а ензимът, който го осъществява, се нарича обратна транскриптаза или ревертаза.
Обратна транскриптаза или обратна транскриптаза, [лат. транскрипция- пренаписване) - ензимът РНК-зависима ДНК полимераза, с помощта на който се извършва обратна транскрипция - синтеза на ДНК върху РНК матрица; кодирани от геномите на някои РНК вируси и мобилни генетични елементи от генома на висши организми, важен „инструмент“ за генното инженерство. Обратната транскриптаза има поне три ензимни активности:
1) ДНК полимераза, която използва както РНК, така и ДНК като матрица;
2) активността на РНКаза Н, която хидролизира РНК като част от РНК-ДНК хибрид, но не и едно- или двуверижна РНК и
3) ДНК ендонуклеазна активност.
Открит независимо от Д. Балтимор и Х. Темин през 1970 г. в РНК-съдържащи туморни вируси (Нобелова награда за 1975 г. заедно с Р. Дулбеко).
И така, обратните транскриптази са способни да синтезират ДНК върху РНК матрица чрез полимеризиране на четири дезоксирибонуклеозид трифосфата. И точно като ДНК полимеразите те функционират само в присъствието на праймер.
Обратните транскриптази се използват при синтеза на двойноверижна ДНК, комплементарна на РНК (особено иРНК), за нейното последващо клониране в плазмидни вектори при получаване на сДНК библиотеки (клонотекс). Обратните транскриптази, подобно на ДНК полимеразите, могат да се използват за въвеждане на радиоактивни или флуоресцентен етикетв ДНК сонди, съдържащи подходящо маркирани дезоксирибонуклеозид трифосфати.
Способността да се синтезира ДНК върху РНК матрица при определени условия е демонстрирана за термостабилната ДНК полимераза на Thermus thermophilus. Това позволява да се използва за директно откриване на специфични РНК в биологични проби чрез PCR. Съвременните модификации на този подход правят възможно в една реакционна смес (и епруветка) да се синтезират в реакция на обратна транскрипция малък брой копия на амплифицирания ДНК фрагмент върху РНК матрица, които веднага се използват от същия ензим като шаблон в конвенционална PCR (една епруветка PCR).
Обратна транскриптаза (обратна или РНК-зависима ДНК полимераза) е ензим, който катализира синтеза на ДНК върху РНК шаблон в процес, наречен „ обратна транскрипция”. Името на процеса отразява обратното на процеса транскрипции, извършва се в другата посока: РНК транскрипт се синтезира от ДНК шаблонна молекула.
Тези ензими са изолирани от РНК вируси ( ретровируси). Обратната транскриптаза се използва от туморни вируси за транскрибиране на иРНК в комплементарната верига на ДНК. При изучаване на ретровируси, чийто геном е представен от едноверижни РНК молекули, беше открито, че по време на вътреклетъчното развитие ретровирусът преминава през етапа на интегриране на своя геном под формата на двойноверижна ДНК в хромозомите на гостоприемника клетка. През 1964 г. Temin изказва хипотезата за съществуването на специфичен за вируса ензим, способен да синтезира комплементарна ДНК върху РНК матрица. Усилията, насочени към изолиране на такъв ензим, бяха увенчани с успех и през 1970 г. Temin и Mizutani, както и независимо Балтимор откриха желания ензим в препарат от извънклетъчни вириони на вируса на саркома на Rous. Тази РНК-зависима ДНК полимераза се нарича обратна транскриптаза или ревертаза.
Ревертазата от птичи ретровируси е изследвана най-подробно. Всеки вирион съдържа около 50 молекули от този ензим. Обратната транскриптаза се състои от две субединици - a (65 kDa) и b (95 kDa), присъстващи в еквимоларни количества. Обратната транскриптаза има поне три ензимни активности:
1) ДНК полимераза, която използва както РНК, така и ДНК като матрица;
2) активността на РНКаза Н, която хидролизира РНК като част от РНК-ДНК хибрид;
3) ДНК ендонуклеазна активност.
Първите две дейности са необходими за синтеза на вирусна ДНК и ендонуклеазата изглежда важна за интегрирането на вирусна ДНК в генома на клетката гостоприемник. Пречистената обратна транскриптаза синтезира ДНК както върху РНК, така и върху ДНК матрици (фиг. 11).
Ориз. 11. Схема за синтез на двойноверижни ДНК копия на РНК молекули
За да започне синтеза, реверсетазата, подобно на други полимерази, изисква къса двойноверижна област (праймер). Праймерът може да бъде едноверижен сегмент от РНК и ДНК, които по време на реакцията стават ковалентно свързани с новосинтезираната ДНК верига. В генното инженерство се използват както олиго-(dT) праймери, комплементарни на 3"-polyA краищата на иРНК, така и набор от хексануклеотиди, „произволни“ по състав и последователност (случайни праймери). Често за РНК молекули с известен първичен последователности, които нямат 3"- поли(А) краища, използват химически синтезирани олигонуклеотиди, комплементарни на 3" края
Обратната транскриптаза се използва предимно за транскрибиране на информационна РНК в комплементарна ДНК (cDNA). Реакцията на обратна транскрипция се провежда при специално подбрани условия, като се използват силни инхибитори на РНКазната активност. В този случай е възможно да се получат пълноразмерни ДНК копия на целевите РНК молекули. След синтеза на комплементарна ДНК верига върху иРНК и разрушаване на РНК (обикновено се използва алкална обработка), се извършва синтеза на втората ДНК верига. В този случай се използва способността на реверсетазата да образува самодопълващи се фиби в 3" краищата на едноверижни сДНК, които могат да служат като праймер.
Шаблонът е първата верига на cDNA. Тази реакция може да се катализира или от обратна реакция, или от ДНК полимераза I на Е. coli. Доказано е, че комбинацията от тези два ензима прави възможно увеличаването на добива на пълни двойноверижни cDNA молекули. В края на синтеза, първата и втората верига на кДНК остават ковалентно свързани чрез бримката на фиби, която служи като праймер по време на синтеза на втората верига. Тази верига се разцепва от ендонуклеаза S1, която специфично разрушава едноверижни участъци от нуклеинови киселини. Краищата, образувани в този случай, не винаги са тъпи и за да се повиши ефективността на последващото клониране, те се поправят до тъпи с помощта на фрагмента Klenow на E. coli ДНК полимераза I. Получената двойноверижна кДНК след това може да бъде вмъкната в клониращи вектори, размножена като част от хибридни ДНК молекули и използвана за по-нататъшни изследвания.
