Професия молекулярен биолог. Молекулярен биолог

Молекулярният биолог е медицински изследовател, чиято мисия е не по-малко от това да спаси човечеството от опасни болести. Сред такива заболявания, например, онкологията, която днес се е превърнала в една от основните причини за смъртността в света, само малко по-ниска от лидера - сърдечно-съдови заболявания. Новите методи за ранна диагностика на онкологията, профилактика и лечение на рак са приоритетна задача на съвременната медицина. Молекулярните биолози в онкологията разработват антитела и рекомбинантни (генно конструирани) протеини за ранна диагностика или целенасочено доставяне на лекарства в тялото. Специалистите в тази област използват най-съвременните постижения на науката и технологиите за създаване на нови организми и органична материяс цел по-нататъшното им използване в изследователска и клинична дейност. Сред методите, които използват молекулярните биолози, са клониране, трансфекция, инфекция, полимеразна верижна реакция, генно секвениране и други. Една от компаниите, които се интересуват от молекулярни биолози в Русия, е PrimeBioMed LLC. Организацията се занимава с производство на реагенти за антитела за диагностика на рак. Такива антитела се използват главно за определяне на вида на тумора, неговия произход и злокачественост, тоест способността за метастазиране (разпространение в други части на тялото). Антителата се прилагат върху тънки участъци от изследваната тъкан, след което се свързват в клетките с определени протеини - маркери, които присъстват в туморните клетки, но липсват в здравите и обратно. В зависимост от резултатите от изследването се предписва по-нататъшно лечение. Сред клиентите на PrimeBioMed са не само медицински, но и научни институции, тъй като антителата могат да се използват и за решаване на изследователски проблеми. В такива случаи могат да бъдат произведени уникални антитела, способни да се свързват с изследвания протеин за конкретна задача по специална поръчка. Друг обещаваща посокаИзследванията на компанията се фокусират върху целенасоченото доставяне на лекарства в тялото. В този случай антителата се използват като транспорт: с тяхна помощ лекарствата се доставят директно до засегнатите органи. Така лечението става по-ефективно и има по-малко негативни последици за организма, отколкото например химиотерапията, която засяга не само раковите клетки, но и други клетки. Очаква се професията на молекулярния биолог да става все по-търсена през следващите десетилетия: с увеличаването на средната продължителност на човешкия живот ще се увеличава броят на раковите заболявания. Ранната диагностика на тумори и иновативните методи за лечение с помощта на вещества, получени от молекулярни биолози, ще спасят живота и ще подобрят качеството му на огромен брой хора.

Комикс за конкурса „био/мол/текст”: Днес епруветката за молекулярни биолог ще ви преведе през света на невероятната наука - молекулярната биология! Ще започнем с исторически екскурз през етапите на неговото развитие, описвайки основните открития и експерименти от 1933 г. Също така ясно ще ви разкажем за основните методи на молекулярната биология, които направиха възможно манипулирането, промяната и изолирането на гени. Появата на тези методи послужи като силен тласък за развитието на молекулярната биология. Нека си припомним и ролята на биотехнологиите и да се докоснем до една от най-популярните теми в тази област – редактирането на генома с помощта на системи CRISPR/Cas.

Генерален спонсор на състезанието и партньор на номинацията Сколтех е .

Спонсор на състезанието е компанията Diaem: най-големият доставчик на оборудване, реактиви и консумативи за биологични изследвания и производство.

Наградата на публиката бе спонсорирана от компанията.

Спонсор "Книга" на конкурса - "Алпина нехудожествена литература"

1. Въведение. Същността на молекулярната биология

Изучава основите на живота на организмите на ниво макромолекули. Целта на молекулярната биология е да установи ролята и механизмите на функциониране на тези макромолекули въз основа на познаването на техните структури и свойства.

Исторически погледнато, молекулярната биология се формира по време на развитието на области на биохимията, които изучават нуклеинови киселини и протеини. Докато биохимията изучава метаболизма, химичния състав на живите клетки, организми и химичните процеси, протичащи в тях, молекулярната биология се фокусира върху изучаването на механизмите на предаване, възпроизвеждане и съхранение на генетична информация.

А обектът на изследване на молекулярната биология са самите нуклеинови киселини - дезоксирибонуклеинови киселини (ДНК), рибонуклеинови киселини (РНК) - и протеини, както и техните макромолекулни комплекси - хромозоми, рибозоми, мултиензимни системи, които осигуряват биосинтезата на протеини и нуклеинова киселина. Молекулярна биологиясъщо граничи с обектите на изследване и частично съвпада с молекулярната генетика, вирусологията, биохимията и редица други сродни биологични науки.

2. Исторически екскурзии в етапите на развитие на молекулярната биология

Като отделен дял от биохимията молекулярната биология започва да се развива през 30-те години на миналия век. Още тогава възниква необходимостта от разбиране на феномена на живота на молекулярно ниво, за да се изследват процесите на предаване и съхранение на генетична информация. По това време задачата на молекулярната биология беше установена в изучаването на свойствата, структурата и взаимодействието на протеините и нуклеиновите киселини.

Терминът "молекулярна биология" е използван за първи път през 1933 година Уилям Астбъри по време на изследване на фибриларни протеини (колаген, кръвен фибрин, мускулни контрактилни протеини). Астбъри изучава връзката между молекулярната структура и биологичните, физически характеристики на тези протеини. В ранните дни на молекулярната биология РНК се смяташе за компонент само на растенията и гъбите, а ДНК - само на животните. И в 1935 Откриването на ДНК на грах от Андрей Белозерски доведе до установяването на факта, че ДНК се съдържа във всяка жива клетка.

IN 1940 През 2009 г. колосално постижение беше установяването от Джордж Бийдъл и Едуард Татъм на причинно-следствената връзка между гените и протеините. Хипотезата на учените „Един ген – един ензим“ е в основата на концепцията, че специфичната структура на протеина се регулира от гени. Смята се, че генетичната информация е кодирана от специална последователност от нуклеотиди в ДНК, която регулира първичната структура на протеините. По-късно беше доказано, че много протеини имат кватернерна структура. В образуването на такива структури участват различни пептидни вериги. Въз основа на това разпоредбата за връзката между гена и ензима беше донякъде трансформирана и сега звучи като „Един ген - един полипептид“.

IN 1944 През 2006 г. американският биолог Осуалд ​​Ейвъри и колегите му (Колин Маклауд и Маклийн Маккарти) доказаха, че веществото, което причинява трансформацията на бактериите, е ДНК, а не протеини. Експериментът послужи като доказателство за ролята на ДНК в предаването на наследствена информация, изтривайки остарелите знания за протеиновата природа на гените.

В началото на 50-те години Фредерик Сангер показа, че протеиновата верига е уникална последователност от аминокиселинни остатъци. IN 1951 И 1952 години ученият определя пълната последователност на две полипептидни вериги – говежди инсулин IN(30 аминокиселинни остатъка) и А(21 аминокиселинни остатъка), съответно.

Приблизително по същото време, в 1951–1953 gg., Erwin Chargaff формулира правила за съотношението на азотните бази в ДНК. Според правилото, независимо от видовите различия на живите организми в тяхната ДНК, количеството на аденин (A) е равно на количеството на тимин (T), а количеството на гуанин (G) е равно на количеството на цитозин. (° С).

IN 1953 Генетичната роля на ДНК е доказана. Джеймс Уотсън и Франсис Крик, въз основа на рентгеновата дифракционна картина на ДНК, получена от Розалинд Франклин и Морис Уилкинс, установиха пространствената структура на ДНК и изложиха хипотеза, която по-късно беше потвърдена, за механизма на нейната репликация (дупликация) , което е в основата на наследствеността.

1958 година - формирането на централната догма на молекулярната биология от Франсис Крик: трансферът на генетична информация протича в посока ДНК → РНК → протеин.

Същността на догмата е, че в клетките има определен насочен поток от информация от ДНК, която от своя страна е оригиналният генетичен текст, състоящ се от четири букви: A, T, G и C. Записан е в двойната спирала на ДНК под формата на последователности от тези букви - нуклеотиди.

Този текст е транскрибиран. И самият процес се нарича транскрипция. По време на този процес се синтезира РНК, която е идентична с генетичния текст, но с разлика: в РНК вместо Т има U (урацил).

Тази РНК се нарича информационна РНК (тРНК), или матрица (тРНК). ИзлъчванеиРНК се осъществява с помощта на генетичния код под формата на триплетни последователности от нуклеотиди. По време на този процес текстът на ДНК и РНК нуклеиновите киселини се преобразува от четирибуквен текст в двадесетбуквен аминокиселинен текст.

Има само двадесет естествени аминокиселини, а в текста на нуклеиновите киселини има четири букви. Поради това чрез генетичния код се извършва превод от четирибуквена азбука към двадесетбуквена, в която всеки три нуклеотида съответстват на аминокиселина. Така че можете да направите до 64 трибуквени комбинации от четири букви, въпреки факта, че има 20 аминокиселини.От това следва, че генетичният код задължително трябва да има свойството на израждане. По това време обаче генетичният код не е бил известен и дори не е започнал да се дешифрира, но Крик вече е формулирал централната си догма.

Въпреки това имаше увереност, че кодът трябва да съществува. По това време вече е доказано, че този код е триплет. Това означава, че конкретно три букви в нуклеиновите киселини ( кодони) отговарят на всяка аминокиселина. Има само 64 от тези кодони, те кодират 20 аминокиселини. Това означава, че всяка аминокиселина съответства на няколко кодона наведнъж.

По този начин можем да заключим, че централната догма е постулат, който гласи, че в клетката възниква насочен поток от информация: ДНК → РНК → протеин. Крик подчерта основното съдържание на централната догма: обратният поток от информация не може да възникне, протеинът не е в състояние да промени генетичната информация.

Това е основното значение на централната догма: протеинът не е в състояние да промени и преобразува информацията в ДНК (или РНК), потокът винаги върви само в една посока.

Известно време след това е открит нов ензим, който не е бил известен по времето, когато е формулирана централната догма - обратна транскриптаза, който синтезира ДНК от РНК. Ензимът е открит във вируси, които имат генетична информация, кодирана в РНК, а не в ДНК. Такива вируси се наричат ​​ретровируси. Те имат вирусна капсула, съдържаща РНК и специален ензим. Ензимът е обратна транскриптаза, която синтезира ДНК, използвайки шаблона на тази вирусна РНК, и тази ДНК след това служи като генетичен материал за по-нататъшното развитие на вируса в клетката.

Разбира се, това откритие предизвика голям шок и много спорове сред молекулярните биолози, тъй като се смяташе, че въз основа на централната догма това не би могло да бъде възможно. Крик обаче веднага обясни, че никога не е казвал, че е невъзможно. Той каза само, че никога не може да възникне поток от информация от протеини към нуклеинови киселини, но в рамките на нуклеиновите киселини е напълно възможен всякакъв вид процес: синтез на ДНК върху ДНК, ДНК върху РНК, РНК върху ДНК и РНК върху РНК.

След като централната догма беше формулирана, редица въпроси все още остават: Как четиринуклеотидната азбука, която изгражда ДНК (или РНК), кодира 20-буквената азбука на аминокиселините, които изграждат протеините? Каква е същността на генетичния код?

Първите идеи за съществуването на генетичен код са формулирани от Александър Даунс ( 1952 ж.) и Георги Гъмов ( 1954 Ж.). Учените са показали, че нуклеотидната последователност трябва да включва най-малко три единици. По-късно е доказано, че такава последователност се състои от три нуклеотида, наречени кодон (триплет). Независимо от това, въпросът кои нуклеотиди са отговорни за включването на коя аминокиселина в протеиновата молекула остава открит до 1961 г.

И в 1961 Маршал Ниренберг и Хайнрих Матей използваха системата за излъчване инвитро. Като шаблон се използва олигонуклеотид. Той съдържаше само остатъци от урацил, а синтезираният от него пептид включваше само аминокиселината фенилаланин. Така за първи път е установено значението на кодона: UUU кодонът кодира фенилаланин. Областта на Хар Корана установи, че нуклеотидната последователност UCUCUCUCUCUC кодира набор от аминокиселини серин-левцин-серин-левцин. Като цяло, благодарение на работата на Ниренберг и Корана, до 1965 година генетичният код е напълно разгадан. Оказа се, че всеки триплет кодира определена аминокиселина. И редът на кодоните определя реда на аминокиселините в протеина.

Основните принципи на функциониране на протеините и нуклеиновите киселини са формулирани в началото на 70-те години. Записано е, че синтезът на протеини и нуклеинови киселини се извършва с помощта на шаблонен механизъм. Матричната молекула носи кодирана информация за последователността на аминокиселините или нуклеотидите. По време на репликация или транскрипция, ДНК служи като шаблон; по време на транслация и обратна транскрипция, иРНК служи като шаблон.

По този начин бяха създадени предпоставки за формирането на области на молекулярната биология, включително генното инженерство. А през 1972 г. Пол Берг и колегите му разработват технология за молекулярно клониране. Учените са получили първата рекомбинантна ДНК инвитро. Тези изключителни открития формират основата на ново направление в молекулярната биология и 1972 Оттогава годината се счита за рождена дата на генното инженерство.

3. Методи на молекулярната биология

Огромният напредък в изследването на нуклеиновите киселини, структурата на ДНК и биосинтезата на протеини доведе до създаването на редица методи, които са от голямо значение в медицината, селското стопанство и науката като цяло.

След изучаването на генетичния код и основните принципи на съхранение, предаване и прилагане на наследствена информация, специални методи станаха необходими за по-нататъшното развитие на молекулярната биология. Тези методи биха позволили гените да бъдат манипулирани, променяни и изолирани.

Появата на такива методи се случи през 70-те и 80-те години на миналия век. Това даде огромен тласък на развитието на молекулярната биология. На първо място, тези методи са пряко свързани с получаването на гени и тяхното въвеждане в клетките на други организми, както и с възможността за определяне на последователността на нуклеотидите в гените.

3.1. ДНК електрофореза

ДНК електрофорезае основен метод за работа с ДНК. ДНК електрофорезата се използва заедно с почти всички други методи за изолиране на желаните молекули и допълнителен анализ на резултатите. Самият метод на гел електрофореза се използва за разделяне на ДНК фрагменти по дължина.

Преди или след електрофореза гелът се третира с багрила, които могат да се свържат с ДНК. Багрилата флуоресцират под ултравиолетова светлина, създавайки шарка от ивици в гела. За да се определят дължините на ДНК фрагментите, те могат да бъдат сравнени с маркери- набори от фрагменти със стандартни дължини, които се нанасят върху един и същ гел.

Флуоресцентни протеини

Когато се изучават еукариотни организми, е удобно да се използват флуоресцентни протеини като маркерни гени. Генът за първия зелен флуоресцентен протеин ( зелен флуоресцентен протеин, GFP), изолиран от медуза Aqeuorea victoria, след което са въведени в различни организми. След това бяха изолирани гени за флуоресцентни протеини с други цветове: синьо, жълто, червено. За да се получат протеини с интересни свойства, такива гени са изкуствено модифицирани.

Като цяло, най-важните инструменти за работа с ДНК молекулата са ензимите, които извършват редица ДНК трансформации в клетките: ДНК полимерази, ДНК лигазиИ рестрикционни ензими (рестрикционни ендонуклеази).

Трансгенеза

Трансгенезасе нарича трансфер на гени от един организъм в друг. И такива организми се наричат трансгенен.

Рекомбинантните протеинови препарати се произвеждат по метода на генен трансфер в микробни клетки. Основно такива протеинови препарати са интерферони, инсулин, някои протеинови хормони, както и протеини за производството на редица ваксини.

В други случаи се използват клетъчни култури от еукариоти или трансгенни животни, предимно говеда, които отделят необходимите протеини в млякото. По този начин се получават антитела, фактори на кръвосъсирването и други протеини. Методът на трансгенезата се използва за получаване на култивирани растения, които са устойчиви на вредители и хербициди, а отпадъчните води се пречистват с помощта на трансгенни микроорганизми.

В допълнение към всичко изброено по-горе, трансгенните технологии са незаменими в научно изследване, тъй като развитието на биологията става по-бързо с използването на методи за модификация и генен трансфер.

Рестрикционни ензими

Последователностите, разпознати от рестрикционните ензими, са симетрични, така че всякакъв вид прекъсвания могат да възникнат или в средата на такава последователност, или с изместване в едната или двете вериги на молекулата на ДНК.

Когато всяка ДНК се смила с рестрикционен ензим, последователностите в краищата на фрагментите ще бъдат същите. Те ще могат да се свържат отново, защото имат допълващи се региони.

Можете да получите една молекула, като съедините тези последователности с помощта на ДНК лигази. Благодарение на това е възможно да се комбинират фрагменти от две различни ДНК и да се получи рекомбинантна ДНК.

3.2. PCR

Методът се основава на способността на ДНК полимеразите да завършат втората верига на ДНК по протежение на комплементарна верига по същия начин, както по време на процеса на репликация на ДНК в клетката.

3.3. ДНК секвениране

Бързото развитие на метода за секвениране дава възможност за ефективно определяне на характеристиките на изследвания организъм на нивото на неговия геном. Основното предимство на такива геномни и постгеномни технологии е повишената способност за изследване и изучаване на генетичната природа на човешките заболявания, за да се вземат необходимите мерки предварително и да се избегнат заболявания.

Чрез широкомащабни изследвания е възможно да се получат необходимите данни за различните генетични характеристики на различни групи хора, като по този начин се разработят медицински методи. Поради това идентифицирането на генетичното предразположение към различни заболявания днес е много популярно.

Подобни методи са широко приложими почти по целия свят, включително и в Русия. Защото научен прогрестакива методи се въвеждат в медицинските изследвания и медицинската практика като цяло.

4. Биотехнология

Биотехнология- дисциплина, която изучава възможностите за използване на живи организми или техните системи за решаване на технологични проблеми, както и създаване на живи организми с желаните свойства чрез генно инженерство. Биотехнологиите прилагат методи на химията, микробиологията, биохимията и, разбира се, молекулярната биология.

Основните насоки на развитие на биотехнологиите (принципите на биотехнологичните процеси се въвеждат в производството на всички индустрии):

1. Създаване и производство на нови видове храни и фуражи.
2. Получаване и изследване на нови щамове микроорганизми.
3. Отглеждане на нови сортове растения, както и създаване на средства за защита на растенията от болести и неприятели.
4. Приложение на биотехнологични методи за екологични нужди. Такива биотехнологични методи се използват за преработка, изхвърляне на отпадъци, почистване Отпадъчни води, отработен въздух и възстановяване на почвата.
5. Производство на витамини, хормони, ензими, серуми за медицински нужди. Биотехнолозите разработват подобрени лекарства, които преди се смятаха за нелечими.

Основно постижение на биотехнологиите е генното инженерство.

Генното инженерство- набор от технологии и методи за получаване на рекомбинантни РНК и ДНК молекули, изолиране на отделни гени от клетки, манипулиране на гени и въвеждането им в други организми (бактерии, дрожди, бозайници). Такива организми са способни да произвеждат крайни продукти с желаните, модифицирани свойства.

Методите на генното инженерство са насочени към конструиране на нови, несъществуващи досега комбинации от гени в природата.

Говорейки за постиженията на генното инженерство, не можем да не засегнем темата за клонирането. Клониранее метод на биотехнология, използван за получаване на идентично потомство на различни организми чрез безполово размножаване.

С други думи, клонирането може да се разглежда като процес на създаване на генетично идентични копия на организъм или клетка. А клонираните организми са подобни или дори идентични не само по външни характеристики, но и по генетично съдържание.

Известната овца Доли стана първият бозайник, клониран през 1966 г. Получава се чрез трансплантиране на ядрото на соматична клетка в цитоплазмата на яйцеклетката. Доли беше генетично копие на овцата, която донори клетъчното ядро. При естествени условия индивидът се формира от едно оплодено яйце, като е получил половината от генетичния материал от двама родители. По време на клонирането обаче генетичният материал е взет от клетката на един индивид. Първо, ядрото, което съдържа самата ДНК, е отстранено от зиготата. След това те извличат ядрото от клетката на възрастна овца и го имплантират в тази зигота, лишена от ядро, след което то се трансплантира в матката на възрастен и осигурява възможност за растеж и развитие.

Не всички опити за клониране обаче бяха успешни. Успоредно с клонирането на Доли е проведен експеримент за заместване на ДНК на други 273 яйцеклетки. Но само в един случай живо възрастно животно успя да се развие и расте напълно. След Доли учените се опитаха да клонират и други видове бозайници.

Един от видовете генно инженерство е редактиране на генома.

Инструментът CRISPR/Cas се основава на елемент от имунната защитна система на бактериите, който учените са адаптирали, за да въведат всякакви промени в ДНК на животни или растения.

CRISPR/Cas е един от биотехнологичните методи за манипулиране на отделни гени в клетките. Има огромен брой приложения за тази технология. CRISPR/Cas позволява на изследователите да разберат функцията на различни гени. За да направите това, просто трябва да изрежете интересния ген от ДНК и да проучите кои функции на тялото са засегнати.

някои практически приложениясистеми:

1. Селско стопанство.Системите CRISPR/Cas могат да се използват за подобряване на културите. А именно да ги направим по-вкусни и питателни, както и топлоустойчиви. Възможно е да се дадат на растенията други свойства: например да се изреже алергенен ген от ядки (фъстъци или лешници).
2. Медицина, наследствени болести.Учените имат за цел да използват CRISPR/Cas за премахване човешки геноммутации, които могат да причинят заболявания като сърповидно-клетъчна анемия и др. На теория развитието на ХИВ може да бъде спряно с помощта на CRISPR/Cas.
3. Генно шофиране. CRISPR/Cas може да промени не само генома на отделно животно или растение, но и генофонда на даден вид. Тази концепция е известна като "генно шофиране". Всеки жив организъм предава половината от своите гени на своето потомство. Но използването на CRISPR/Cas може да увеличи вероятността за трансфер на гени с до 100%. Това е важно, за да може желаната черта да се разпространи по-бързо в популацията.

Швейцарски учени значително подобриха и модернизираха метода за редактиране на генома CRISPR/Cas, като по този начин разшириха неговите възможности. Учените обаче могат да променят само един ген наведнъж, използвайки системата CRISPR/Cas. Но сега изследователи от ETH Zurich са разработили метод, който може едновременно да модифицира 25 гена в клетка.

За най-новата техника експертите са използвали ензима Cas12a. Генетици успешно клонираха маймуни за първи път в историята. "Популярна механика";

Развитието на биохимията, биофизиката, генетиката, цитохимията, много клонове на микробиологията и вирусологията около началото на 40-те години на 20 век. доведе тясно до изучаването на жизнените явления на молекулярно ниво. Успехите, постигнати от тези науки, едновременно и от различни страни, доведоха до осъзнаването на факта, че на молекулярно ниво функционират основните контролни системи на тялото и че по-нататъшният прогрес на тези науки ще зависи от разкриването на биологичните функции на молекулите, изграждащи телата на организмите, тяхното участие в синтеза и разпадането, взаимните трансформации и възпроизводството на съединенията в клетката, както и произтичащия от това обмен на енергия и информация. И така, в пресечната точка на тези биологични дисциплини с химия и физика, напълно нова индустрия- молекулярна биология.

За разлика от биохимията, вниманието на съвременната молекулярна биология е насочено предимно към изучаването на структурата и функцията на най-важните класове биополимери - протеини и нуклеинови киселини, първите от които определят самата възможност за метаболитни реакции, а вторите - биосинтеза на специфични протеини. Следователно е ясно, че е невъзможно да се направи ясно разграничение между молекулярната биология и биохимията, съответните раздели на генетиката, микробиологията и вирусологията.

Появата на молекулярната биология е тясно свързана с разработването на нови изследователски методи, които вече бяха обсъдени в съответните глави. Наред с развитието на електронната микроскопия и други методи на микроскопската технология, разработените през 50-те години методи за фракциониране на клетъчни елементи играят важна роля. Те се основават на подобрени методи за диференциално центрофугиране (A. Claude, 1954). По това време вече съществуват доста надеждни методи за изолиране и фракциониране на биополимери. Това включва по-специално метода на протеиново фракциониране с помощта на електрофореза, предложен от А. Тиселиус (1937; Нобелова награда, 1948), методи за изолиране и пречистване на нуклеинови киселини (Е. Кей, А. Даунс, М. Севаг, А. , Мирски и др.). В същото време в много лаборатории по света са разработени различни методи за хроматографски анализ (A. Martin и R. Singh, 1941; Нобелова награда, 1952), впоследствие значително подобрени.

Рентгеновият дифракционен анализ изигра безценна услуга при дешифрирането на структурата на биополимерите. Основните принципи на рентгеновия дифракционен анализ са разработени в King's College, Лондонския университет, под ръководството на W. Bragg, от група изследователи, включваща J. Bernal, A. Lonsdale, W. Astbury, J. Robertson и други.

Особено внимание заслужава изследването на проф. Московски държавен университет A. R. Kizel за биохимията на протоплазмата (1925 - 1929), които са от голямо значение за последващото развитие на молекулярната биология. Кизел нанесе удар на твърдо вкоренената идея, че в основата на всяка протоплазма лежи специално протеиново тяло - плочите, които уж определят всички нейни най-важни структурни и функционални характеристики. Той показа, че пластинът е протеин, който се намира само в миксомицетите, и то на определен етап от развитието, и че в протоплазмата не съществува постоянен компонент - единичен скелетен протеин. Така изследването на проблема за структурата на протоплазмата и функционалната роля на протеините пое по правилния път и получи поле за развитие. Изследванията на Кизел спечелиха световно признание, стимулирайки изучаването на химията компонентиклетки.

Терминът "молекулярна биология", използван за първи път от английския кристалограф, професор от университета в Лийдс У. Астбъри, вероятно се е появил в началото на 40-те години (преди 1945 г.). Изследванията на Астбъри с рентгенова дифракция на протеини и ДНК през 30-те години на миналия век осигуряват основата за неговото последващо успешно дешифриране на вторичната структура на тези биополимери. През 1963 г. Дж. Бернал пише: „Паметник ще му бъде издигнат от цялата молекулярна биология - науката, която той назова и всъщност основа“ * В литературата този термин се появява за първи път може би през 1946 г. статия на W. Astbury „Прогрес на рентгеновия дифракционен анализ на органични и фибриларни съединения“, публикувана в английското списание Nature **. В своята лекция на Харви Астбъри (1950) отбелязва: "Доволен съм, че терминът молекулярна биология сега се използва доста широко, въпреки че е малко вероятно аз да съм бил първият, който го е предложил. Хареса ми и отдавна се опитвам да го разпространя. ” *** . Още през 1950 г. Астбъри е ясно, че молекулярната биология се занимава основно със структурата и конформацията на макромолекулите, чието изследване е от решаващо значение за разбирането на функционирането на живите организми.

* (биогр. Мем. Колеги Рой. Soc, 1963, v. 9, 29.)

** (У. Т. Астбъри. Напредък на рентгеновия анализ на органични и влакнести структури.- Природа,. 1946 г., с. 157, 121.)

*** (У. Т. Астбъри. Приключения в молекулярната биология. Томас Спрингфийлд, 1952 г., стр. 3.)

Молекулярната биология е изправена и се сблъсква всъщност със същите задачи като цялата биология като цяло - познаване на същността на живота и неговите основни явления, по-специално като наследственост и изменчивост. Съвременната молекулярна биология има за цел да дешифрира структурата и функцията на гените, пътищата и механизмите за внедряване на генетична информация на организми на различни етапи от онтогенезата и при различни етапичетейки го. Той е предназначен да разкрие фините механизми на регулиране на генната активност и клетъчната диференциация, да изясни природата на мутагенезата и молекулярната основа на еволюционния процес.

Установяване на генетичната роля на нуклеиновите киселини

За развитието на молекулярната биология най-висока стойностимаше следните открития. През 1944 г. американските изследователи О. Ейвъри, К. Маклеод (Нобелова награда, 1923 г.) и М. Маккарти показват, че ДНК молекулите, изолирани от пневмококи, имат трансформираща активност. След хидролиза на тези ДНК с дезоксирибонуклеаза, тяхната трансформираща активност напълно изчезва. Така за първи път беше убедително доказано, че ДНК, а не протеинът, е надарен с генетични функции в клетката.

За да бъдем честни, трябва да се отбележи, че феноменът на бактериалната трансформация е открит много по-рано от откритието на Ейвъри, Маклауд и Маккарти. През 1928 г. Ф. Грифит публикува статия, в която съобщава, че след добавяне на убити клетки от капсулиран вирулентен щам към невирулентни (некапсулирани) пневмококи, получената смес от клетки става разрушителна за мишките. Освен това живите пневмококови клетки, изолирани от животни, заразени с тази смес, вече са били вирулентни и са имали полизахаридна капсула. По този начин в този експеримент беше показано, че под въздействието на някои компоненти на убити пневмококови клетки, некапсулираната форма на бактериите се превръща в капсулообразуваща вирулентна форма. 16 години по-късно Ейвъри, Маклауд и Маккарти заменят убитите цели пневмококови клетки с тяхната дезоксирибонуклеинова киселина в този експеримент и показват, че именно ДНК има трансформираща активност (виж също глави 7 и 25). Значението на това откритие е трудно да се надцени. То стимулира изследването на нуклеиновите киселини в много лаборатории по света и принуждава учените да насочат вниманието си към ДНК.

Заедно с откритието на Ейвъри, Маклауд и Маккарти, до началото на 50-те години вече са натрупани доста голямо количество преки и косвени доказателства, че нуклеиновите киселини играят изключителна роля в живота и имат генетична функция. Това, по-специално, беше показано от естеството на локализацията на ДНК в клетката и данните на R. Vendrely (1948), че съдържанието на ДНК на клетка е строго постоянно и корелира със степента на плоидност: в хаплоидните зародишни клетки има е наполовина по-малко ДНК, отколкото в диплоидните соматични клетки. Генетичната роля на ДНК се подкрепя и от нейната изразена метаболитна стабилност. До началото на 50-те години се натрупаха много различни факти, които показват, че повечето от известните мутагенни фактори действат предимно върху нуклеиновите киселини и по-специално върху ДНК (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E. Freese, 1957 и др.).

От особено значение за установяване на генетичната роля на нуклеиновите киселини беше изследването на различни фаги и вируси. През 1933 г. Д. Шлезингер открива ДНК в бактериофага Escherichia coli. След изолирането на вируса на тютюневата мозайка (TMV) в кристално състояние от W. Stanley (1935 г., Нобелова награда, 1946 г.) започва нов етап в изследването на растителните вируси. През 1937 - 1938г F. Bowden и N. Pirie, служители на Rothamsted Agricultural Station (Англия), показаха, че много изолирани от тях растителни вируси не са глобулини, а рибонуклеопротеини и съдържат нуклеинова киселина като задължителен компонент. В самото начало на 40-те години бяха публикувани трудовете на G. Schramm (1940), P. A. Agatov (1941), G. Miller и W. Stanley (1941), които показват, че забележимата химическа модификация на протеиновия компонент не води до загуба на TMV инфекциозност. Това показва, че протеиновият компонент не може да бъде носител на наследствените свойства на вируса, както продължават да вярват много микробиолози. Убедителни доказателства в полза на генетичната роля на нуклеиновата киселина (РНК) в растителните вируси са получени през 1956 г. от G. Schramm в Тюбинген (Германия) и H. Frenkel-Konrath в Калифорния (САЩ). Тези изследователи, почти едновременно и независимо един от друг, изолираха РНК от TMV и показаха, че именно тя, а не протеинът, е инфекциозен: в резултат на заразяване на тютюневите растения с тази РНК се образуват и размножават нормални вирусни частици в тях. Това означава, че РНК съдържа информация за синтеза и сглобяването на всички вирусни компоненти, включително вирусния протеин. През 1968 г. И. Г. Атабеков установява, че протеинът играе важна роля в самата инфекция на растенията - природата на протеина определя обхвата на растенията гостоприемници.

През 1957 г. Frenkel-Konrath е първият, който реконструира TMV от съставните му компоненти - РНК и протеин. Наред с нормалните частици той получава смесени „хибриди“, в които РНК е от един щам, а протеинът от друг. Наследствеността на такива хибриди беше напълно определена от РНК и потомството на вирусите принадлежеше на щама, чиято РНК беше използвана за получаване на оригиналните смесени частици. По-късните експерименти на A. Gierer, G. Schuster и G. Schramm (1958) и G. Vitman (1960 - 1966) показват, че химическата модификация на нуклеиновия компонент на TMV води до появата на различни мутанти на този вирус.

През 1970 г. Д. Балтимор и Г. Темин установяват, че трансферът на генетична информация може да се осъществи не само от ДНК към РНК, но и обратно. Те откриха в някои онкогенни РНК вируси (онкорнавируси) специален ензим, така наречената обратна транскриптаза, който е способен да синтезира допълнително ДНК върху РНК вериги. Това голямо откритие направи възможно да се разбере механизмът на вмъкване на генетична информация на РНК-съдържащи вируси в генома на гостоприемника и да се погледне по нов начин природата на тяхното онкогенно действие.

Откриване на нуклеинови киселини и изследване на техните свойства

Терминът нуклеинови киселини е въведен от немския биохимик R. Altmann през 1889 г., след като тези съединения са открити през 1869 г. от швейцарския лекар F. Miescher. Miescher екстрахира гнойни клетки с разреден солна киселинав рамките на няколко седмици и остана с почти чист ядрен материал. Той смята този материал за характерно „вещество на клетъчните ядра и го нарича нуклеин. По свойствата си нуклеинът се различава рязко от протеините: той е по-киселинен, не съдържа сяра, но има много фосфор, добре се разтваря в основи, но не се разтварят в разредени киселини.

Miescher изпраща резултатите от своите наблюдения на нуклеина на F. Hoppe-Seyler за публикуване в списанието. Описаното от него вещество беше толкова необичайно (по това време сред всички биологични фосфорсъдържащи съединения беше известен само лецитинът), че Хопе-Сейлер не повярва на експериментите на Мишер, върна му ръкописа и инструктира служителите си Н. Плош и Н. Любавин да провери изводите си върху друг материал . Работата на Miescher „За химическия състав на гнойните клетки“ е публикувана две години по-късно (1871). В същото време бяха публикувани трудове на Hoppe-Seyler и неговите колеги за състава на гнойни клетки, еритроцити на птици, змии и други клетки. През следващите три години нуклеинът е изолиран от животински клетки и дрожди.

В своята работа Miescher отбелязва, че подробното изследване на различни нуклеини може да доведе до установяване на разлики между тях, като по този начин предвижда идеята за специфичност на нуклеинова киселина. Изучавайки млякото от сьомга, Miescher открива, че нуклеинът присъства в него под формата на сол и е свързан с основния протеин, който той нарича протамин.

През 1879 г. А. Косел започва да изучава нуклеини в лабораторията на Hoppe-Seyler. През 1881 г. той изолира хипоксантин от нуклеин, но по това време все още се съмняваше в произхода на тази основа и вярваше, че хипоксантинът може да бъде продукт на разграждане на протеини. През 1891 г. сред продуктите на нуклеинова хидролиза Косел открива аденин, гуанин, фосфорна киселина и друго вещество със свойствата на захар. За изследванията си върху химията на нуклеиновите киселини Косел получава Нобелова награда през 1910 г.

По-нататъшният напредък в дешифрирането на структурата на нуклеиновите киселини е свързан с изследванията на P. Levin и сътрудници (1911 - 1934). През 1911 г. P. Levin и V. Jacobs идентифицират въглехидратния компонент на аденозин и гуанозин; те откриха, че тези нуклеозиди съдържат D-рибоза. През 1930 г. Левин показа, че въглехидратният компонент на дезоксирибонуклеозидите е 2-дезокси-D-рибоза. От работата му стана известно, че нуклеиновите киселини са изградени от нуклеотиди, т.е. фосфорилирани нуклеозиди. Люин вярва, че основният тип връзка в нуклеиновите киселини (РНК) е 2", 5" фосфодиестерна връзка. Тази идея се оказа грешна. Благодарение на работата на английския химик А. Тод (Нобелова награда, 1957 г.) и неговите колеги, както и английските биохимици Р. Маркъм и Дж. Смит, в началото на 50-те години стана известно, че основният тип връзка в РНК е 3", 5"- фосфодиестерна връзка.

Левин показа, че различните нуклеинови киселини могат да се различават по естеството на въглехидратния компонент: някои от тях съдържат захарта дезоксирибоза, докато други съдържат рибоза. В допълнение, тези два вида нуклеинови киселини се различават по природата на една от базите: нуклеиновите киселини от типа пентоза съдържат урацил, а нуклеиновите киселини от типа дезоксипентоза съдържат тимин. Дезоксипентозната нуклеинова киселина (в съвременната терминология дезоксирибонуклеинова киселина - ДНК) обикновено се изолира лесно в големи количества от тимусната жлеза на телетата. Поради това получава името тимонуклеинова киселина. Източникът на пентоза нуклеинова киселина (РНК) е главно дрожди и пшеничен зародиш. Този тип често се нарича нуклеинова киселина на дрожди.

В началото на 30-те години идеята, че растителните клетки се характеризират с нуклеинова киселина от типа на дрождите, а тимонуклеиновата киселина е характерна само за ядрата на животинските клетки, беше доста здраво вкоренена. Двата вида нуклеинови киселини - РНК и ДНК - по това време се наричаха съответно растителни и животински нуклеинови киселини. Въпреки това, както показват ранните изследвания на А. Н. Белозерски, такова разделяне на нуклеинови киселини е неоправдано. През 1934 г. Белозерски за първи път открива тимонуклеинова киселина в растителни клетки: от грахови кълнове той изолира и идентифицира тимин-пиримидинова база, характерна за ДНК. След това открива тимин в други растения (семена от соя, боб). През 1936 г. А. Н. Белозерски и И. И. Дубровская изолират препаративна ДНК от разсад от конски кестен. В допълнение, серия от работи, извършени през 40-те години в Англия от Д. Дейвидсън и неговите колеги, убедително показаха, че растителната нуклеинова киселина (РНК) се съдържа в много животински клетки.

Широкото използване на цитохимичната реакция за ДНК, разработена от R. Felgen и G. Rosenbeck (1924) и реакцията на J. Brachet (1944) за РНК, позволи доста бързо и недвусмислено да се реши въпросът за преференциалната локализация на тези нуклеинови киселини в клетката. Оказа се, че ДНК е концентрирана в ядрото, докато РНК е концентрирана предимно в цитоплазмата. По-късно беше установено, че РНК се съдържа както в цитоплазмата, така и в ядрото и освен това беше идентифицирана цитоплазмената ДНК.

Що се отнася до въпроса за първичната структура на нуклеиновите киселини, до средата на 40-те години идеята на П. Левин е твърдо установена в науката, според която всички нуклеинови киселини са изградени по един и същ тип и се състоят от идентични така наречени тетрануклеотидни блокове. Всеки от тези блокове, според Левин, съдържа четири различни нуклеотида. Тетрануклеотидната теория за структурата на нуклеиновите киселини до голяма степен лиши тези биополимери от специфичност. Ето защо не е изненадващо, че по това време цялата специфика на живите същества се свързваше само с протеини, природата на чиито мономери е много по-разнообразна (20 аминокиселини).

Първата дупка в теорията за тетрануклеотидната структура на нуклеиновите киселини е направена от аналитичните данни на английския химик Дж. Гуланд (1945 - 1947). Когато определя състава на нуклеиновите киселини въз основа на азота на базите, той не получава еквимоларно съотношение на базите, както би трябвало да бъде според теорията на Левин. Тетрануклеотидната теория за структурата на нуклеиновите киселини окончателно се срина в резултат на изследванията на Е. Чаргаф и неговите колеги (1949 - 1951). За отделяне на базите, освободени от ДНК в резултат на нейното киселинна хидролиза, Чаргаф използва хартиена хроматография. Всяка от тези бази беше прецизно определена спектрофотометрично. Чаргаф забелязва значителни отклонения от еквимоларното съотношение на базите в ДНК от различен произход и за първи път категорично заявява, че ДНК има изразена видова специфичност. Това сложи край на хегемонията на концепцията за протеиновата специфичност в живата клетка. Анализирайки ДНК от различен произход, Чаргаф открива и формулира уникални модели на състава на ДНК, които навлизат в науката под името правила на Чаргаф. Съгласно тези правила във всички ДНК, независимо от произхода, количеството аденин е равно на количеството тимин (A = T), количеството гуанин е равно на количеството цитозин (G = C), броят на пурините е равно на броя на пиримидините (G + A = C + T), количеството бази с 6-амино групи е равно на броя на базите с 6-кето групи (A+C=G+T). В същото време, въпреки толкова строги количествени съответствия, ДНК различни видовесе различават в стойността на съотношението A+T:G+C. В някои ДНК количеството на гуанин и цитозин преобладава над количеството на аденин и тимин (Чаргаф нарича тези ДНК GC-тип ДНК); други ДНК съдържат повече аденин и тимин, отколкото гуанин и цитозин (тези ДНК се наричат ​​АТ-тип ДНК). Получените от Чаргаф данни за състава на ДНК изиграха изключителна роля в молекулярната биология. Те формират основата за откритието на структурата на ДНК, направено през 1953 г. от Дж. Уотсън и Ф. Крик.

Още през 1938 г. У. Астбъри и Ф. Бел, използвайки рентгенов дифракционен анализ, показаха, че равнините на базите в ДНК трябва да са перпендикулярни на дългата ос на молекулата и да приличат на купчина плочи, разположени една върху друга . Тъй като технологията на рентгеновия структурен анализ се усъвършенства, до 1952 - 1953 г. е натрупана информация, която дава възможност да се прецени дължината на отделните връзки и ъглите на наклон. Това направи възможно да се представи с най-голяма вероятност природата на ориентацията на пръстените на пентозните остатъци в захарно-фосфатния скелет на молекулата на ДНК. През 1952 г. С. Фарберг предлага два спекулативни модела на ДНК, които представляват едноверижна молекула, нагъната или усукана върху себе си. Също толкова спекулативен модел на структурата на ДНК е предложен през 1953 г. от Л. Полинг (носител на Нобелова награда, 1954 г.) и Р. Кори. В този модел три усукани нишки на ДНК образуват дълга спирала, чието ядро ​​е представено от фосфатни групи, а базите са разположени извън нея. До 1953 г. М. Уилкинс и Р. Франклин получават по-ясни рентгенови модели на ДНК. Техният анализ показа пълния провал на моделите на Фарберг, Полинг и Кори. Използвайки данните на Chargaff, сравнявайки различни комбинации от молекулярни модели на отделни мономери и данни от рентгенова дифракция, J. Watson и F. Crick през 1953 г. стигат до извода, че молекулата на ДНК трябва да бъде двуверижна спирала. Правилата на Чаргаф рязко ограничават броя на възможните подредени комбинации от бази в предложения ДНК модел; те предложиха на Уотсън и Крик, че молекулата на ДНК трябва да има специфично сдвояване на основите - аденин с тимин и гуанин с цитозин. С други думи, аденинът в една верига на ДНК винаги стриктно съответства на тимина в друга верига, а гуанинът в една верига задължително съответства на цитозина в друга. Така Уотсън и Крик първи формулират изключително важния принцип на комплементарната структура на ДНК, според който една верига на ДНК допълва другата, т.е. последователността на базите на една верига еднозначно определя последователността на базите в другата ( комплементарна) верига. Стана очевидно, че самата структура на ДНК вече съдържа потенциал за нейното точно възпроизвеждане. Този модел на ДНК структура вече е общоприет. За дешифрирането на структурата на ДНК, Крик, Уотсън и Уилкинс са удостоени с Нобелова награда през 1962 г.

Трябва да се отбележи, че идеята за механизъм за точно възпроизвеждане на макромолекули и предаване на наследствена информация се заражда у нас. През 1927 г. Н. К. Колцов предполага, че по време на клетъчното възпроизвеждане възпроизвеждането на молекулите става чрез точното автокаталитично възпроизвеждане на съществуващите майчини молекули. Вярно, по това време Колцов надари това свойство не с ДНК молекули, а с молекули от протеинова природа, чието функционално значение тогава беше неизвестно. Въпреки това самата идея за автокаталитичното възпроизвеждане на макромолекулите и механизма на предаване на наследствени свойства се оказа пророческа: тя се превърна в водеща идея на съвременната молекулярна биология.

Дългосрочните изследвания (1957-1974) на състава на ДНК в повечето различни организми напълно потвърдиха моделите, открити от Чаргаф, и пълното съответствие с молекулярния модел на структурата на ДНК, предложен от Уотсън и Крик. Тези изследвания показват, че ДНК на различни бактерии, гъби, водорасли, актиномицети, висши растения, безгръбначни и гръбначни животни има специфичен състав. Разликите в състава (съдържанието на AT базови двойки) са особено изразени при микроорганизмите, което се оказва важна таксономична характеристика. При висшите растения и животни видовете специфични вариации в състава на ДНК са много по-слабо изразени. Но това не означава, че тяхната ДНК е по-малко специфична. В допълнение към състава на базите, специфичността до голяма степен се определя от тяхната последователност в ДНК веригите.

Наред с обикновените бази, в ДНК и РНК са открити допълнителни азотни бази. Така G. White (1950) открива 5-метилцитозин в ДНК на растения и животни, а D. Dunn и J. Smith (1958) откриват метилиран аденин в някои ДНК. Метилцитозинът отдавна се смята за отличителен белег на генетичния материал на висшите организми. През 1968 г. А. Н. Белозерски, Б. Ф. Ванюшин и Н. А. Кокурина установяват, че той може да бъде открит и в ДНК на бактериите.

През 1964 г. М. Голд и Дж. Хурвиц откриват нов класензими, които извършват естествена модификация на ДНК - нейното метилиране. След това откритие стана ясно, че минорни (съдържащи се в малки количества) бази се появяват върху готовата полинуклеотидна верига на ДНК в резултат на специфично метилиране на цитозин и аденинови остатъци в специални последователности. По-специално, според Б. Ф. Ванюшин, Я. И. Бурянов и А. Н. Белозерски (1969), метилирането на аденин в ДНК на Escherichia coli може да се случи в стоп кодони. Според A. N. Belozersky и сътрудници (1968 - 1970), както и M. Meselson (САЩ) и V. Arber (Швейцария) (1965 - 1969), метилирането придава на ДНК молекулите уникални индивидуални характеристики и в комбинация с действието на специфични нуклеази, е част от сложен механизъм, който контролира синтеза на ДНК в клетката. С други думи, естеството на метилирането на определена ДНК определя дали тя може да се възпроизвежда в дадена клетка.

Почти по същото време започва изолирането и интензивното изследване на ДНК метилазите и рестрикционните ендонуклеази; през 1969-1975г са установени нуклеотидни последователности, разпознати в ДНК от някои от тези ензими (X. Boyer, X. Smith, S. Lynn, K. Murray). Когато различни ДНК се хидролизират от рестрикционен ензим, се освобождават доста големи фрагменти с идентични „лепкави“ краища. Това дава възможност не само да се анализира структурата на гените, както е направено при малки вируси (D. Nathans, S. Adler, 1973 - 1975), но и да се конструират различни геноми. С откриването на тези специфични рестрикционни ензими, генното инженерство стана осезаема реалност. Гени от различен произход, вградени в малка плазмидна ДНК, вече лесно се въвеждат в различни клетки. Така бяха получени нов тип биологично активни плазмиди, които дадоха резистентност към определени антибиотици (S. Cohen, 1973), рибозомни гени на жаба и Drosophila бяха въведени в плазмидите на Escherichia coli (J. Morrow, 1974; H. Boyer, D. Хогнес, Р. Дейвис, 1974 - 1975). По този начин са открити реални пътища за получаване на принципно нови организми чрез въвеждане и интегриране на различни гени в техния генофонд. Това откритие може да се използва в полза на цялото човечество.

През 1952 г. Г. Уайт и С. Коен откриват, че ДНК на Т-четните фаги съдържа необичайна основа - 5-хидроксиметилцитозин. По-късно, от трудовете на E. Volkin и R. Sinsheimer (1954) и Cohen (1956), става известно, че хидроксиметилцитозиновите остатъци могат да бъдат напълно или частично глюкозидирани, в резултат на което фаговата ДНК молекула е защитена от хидролитично действие на нуклеази.

В началото на 50-те години от трудовете на Д. Дън и Дж. Смит (Англия), С. Заменхоф (САЩ) и А. Вакер (Германия) стана известно, че много изкуствени аналози на бази могат да бъдат включени в ДНК, понякога заменяйки до 50% Timina. По правило тези замествания водят до грешки в репликацията, ДНК транскрипцията и транслацията и появата на мутанти. Така J. Marmur (1962) установи, че ДНК на някои фаги съдържа хидроксиметилурацил вместо тимин. През 1963 г. И. Такахаши и Дж. Мармур откриват, че ДНК на един от фагите съдържа урацил вместо тимин. По този начин се срина друг принцип, по който нуклеиновите киселини преди това бяха разделени. От времето на произведенията на П. Левин се смяташе, че отличителен белегДНК е тимин, а РНК е урацил. Стана ясно, че този признак не винаги е надежден и основната разлика в химичната природа на двата вида нуклеинови киселини, както изглежда днес, е само природата на въглехидратния компонент.

По време на изследването на фагите бяха разкрити много необичайни характеристики на организацията на нуклеиновите киселини. От 1953 г. се смяташе, че всички ДНК са двуверижни линейни молекули, а РНК е само едноверижна. Тази позиция е значително разклатена през 1961 г., когато R. Sinsheimer открива, че ДНК на фага φ X 174 е представена от едноверижна кръгова молекула. Вярно, по-късно се оказа, че в тази форма тази ДНК съществува само във вегетативната фагова частица, а репликативната форма на ДНК на този фаг също е двуверижна. Освен това се оказа доста неочаквано, че РНК на някои вируси може да бъде двуверижна. Този нов тип макромолекулна организация на РНК е открита през 1962 г. от P. Gomatos, I. Tamm и други изследователи в някои животински вируси и в туморен вирус на растителна рана. Наскоро В. И. Агол и А. А. Богданов (1970) установиха, че в допълнение към линейните РНК молекули има и затворени или циклични молекули. Те идентифицират циклична двойноверижна РНК, по-специално във вируса на енцефаломиелокардит. Благодарение на работата на X. Deveau, L. Tinoko, T. I. Tikhonenko, E. I. Budovsky и други (1960 - 1974) станаха известни основните характеристики на организацията (полагане) на генетичен материал в бактериофагите.

В края на 50-те години американският учен П. Доти установи, че при нагряване настъпва денатурация на ДНК, придружена от разкъсване на водородни връзки между базовите двойки и разминаване на комплементарни вериги. Този процес има характер на фазов преход „спирала-намотка“ и наподобява топенето на кристали. Следователно Доти нарече процеса на термична денатурация на ДНК стапяне на ДНК. При бавно охлаждане настъпва ренатурация на молекулите, т.е. повторно обединяване на допълващите се половини.

Принципът на ренатурация е използван през 1960 г. от J. Marmur и K. Schildkraut за определяне на степента на "хибридизация" на ДНК на различни микроорганизми. Впоследствие Е. Болтън и Б. Маккарти усъвършенстват тази техника, като предлагат метода на така наречените колони с ДНК агар. Този метод се оказа незаменим при изследване на степента на хомология на нуклеотидната последователност на различни ДНК и определяне на генетичната връзка на различни организми. Денатурирането на ДНК, открито от Доти в комбинация с хроматография върху метилиран албумин и центрофугиране в градиент на плътност, описано от J. Mandel и A. Hershey * (1960) (методът е разработен през 1957 г. от M. Meselson, F. Stahl и D. Winograd) е широко използвани за разделяне, изолиране и анализ на отделни комплементарни ДНК вериги.Например, W. Szybalski (САЩ), използвайки тези техники за разделяне на ламбда фагова ДНК, показа през 1967 - 1969 г., че и двете фагови вериги са генетично активни, а не само една , тъй като това е общоприето (S. Spigelman, 1961). Трябва да се отбележи, че за първи път идеята за генетичното значение на двете ДНК вериги на ламбда фага е изразена в СССР от S. E. Bresler (1961).

* (За работата си върху генетиката на бактериите и вирусите А. Хърши, заедно с М. Делбрюк и С. Лурия, са удостоени с Нобелова награда през 1969 г.)

За да се разбере организацията и функционалната активност на генома, определянето на нуклеотидната последователност на ДНК е от първостепенно значение. Търсенето на методи за такова определяне продължава в много лаборатории по света. В САЩ М. Биър и колегите му се опитват да установят последователността на ДНК с помощта на електронна микроскопия от края на 50-те години, но досега безуспешно. В началото на 50-те години, от първите трудове на Sinsheimer, Chargaff и други изследователи върху ензимното разграждане на ДНК, стана известно, че различните нуклеотиди в молекулата на ДНК са разпределени, макар и нехаотично, неравномерно. Според английския химик К. Бартън (1961) пиримидините (повече от 70%) са концентрирани главно под формата на съответни блокове. A.L. Mazin и B.F. Vanyushin (1968 - 1969) установиха, че различните ДНК имат различна степен на блокиране на пиримидин и че в ДНК на животински организми тя се увеличава значително, когато те се движат от по-ниско към по-високо. По този начин еволюцията на организмите се отразява в структурата на техните геноми. Ето защо за разбирането на еволюционния процес като цяло сравнителното изследване на структурата на нуклеиновите киселини е от особено значение. Анализът на структурата на биологично важни полимери и на първо място на ДНК е изключително важен за решаването на много специфични проблеми на филогенетиката и таксономията.

Интересно е да се отбележи, че английският физиолог Е. Ланкестър, който изучава хемоглобините на мекотелите и предусеща идеите на молекулярната биология точно преди 100 години, пише: „Химическите различия между различните видове и родове животни и растения са толкова важни за изясняване на историята на техния произход като разлики в тяхната форма. Ако можем ясно да установим разликите в молекулярната организация и функционирането на организмите, бихме могли да разберем произхода и еволюцията на различните организми много по-добре, отколкото въз основа на морфологични наблюдения. Значението на биохимичните изследвания за таксономията беше подчертано и от В. Л. Комаров, който пише, че „в основата на всички, дори чисто морфологични характеристики, въз основа на които класифицираме и установяваме видове, са именно биохимичните различия“ **.

* (Е. Р. Ланкестър. Uber das Vorcommen von Hemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen.- "Pfluger's Archiv fur die gesammte Physiol.", 1871, Bd 4, 319.)

** (В. Л. Комаров. Избрани произведения, т. 1. М.-Л., Издателство на Академията на науките на СССР, 1945 г., стр. 331.)

През 20-те години на миналия век А. В. Благовещенски и С. Л. Иванов правят първите стъпки у нас за изясняване на някои въпроси от еволюцията и систематиката на организмите въз основа на сравнителен анализ на техния биохимичен състав (виж Глава 2). Сравнителен анализструктурата на протеините и нуклеиновите киселини сега се превръща във все по-осезаема помощ за таксономистите (виж Глава 21). Този метод на молекулярната биология позволява не само да се изясни позицията на отделните видове в системата, но и ни принуждава да хвърлим нов поглед върху самите принципи на класификация на организмите, а понякога и да преразгледаме цялата система като цяло, както се случи , например, с таксономията на микроорганизмите. Несъмнено в бъдеще анализът на структурата на генома ще заеме централно място в хемосистематиката на организмите.

Дешифрирането на механизмите на репликация и транскрипция на ДНК е от голямо значение за развитието на молекулярната биология (виж глава 24).

Биосинтеза на протеини

Важна промяна в решаването на проблема с биосинтезата на протеини е свързана с напредъка в изследването на нуклеиновите киселини. През 1941 г. T. Kasperson (Швеция) и през 1942 г. J. Brachet (Белгия) обръщат внимание на факта, че тъканите с активен протеинов синтез съдържат повишено количество РНК. Те заключават, че рибонуклеиновите киселини играят решаваща роля в синтеза на протеини. През 1953 г. Е. Гейл и Д. Фокс изглежда са получили пряко доказателство за прякото участие на РНК в биосинтезата на протеини: според техните данни рибонуклеазата значително потиска включването на аминокиселини в лизатите на бактериалните клетки. Подобни данни са получени от V. Allfrey, M. Deli и A. Mirsky (1953) върху чернодробни хомогенати. По-късно Е. Гейл изостави правилната идея, изразена от него за водещата роля на РНК в синтеза на протеини, погрешно вярвайки, че активирането на синтеза на протеини в безклетъчна система е настъпило под въздействието на някакво друго вещество с неизвестна природа. През 1954 г. P. Zamecnik, D. Littlefield, R. B. Hesin-Lurie и други откриват, че най-активното включване на аминокиселини става в богатите на РНК фракции на субклетъчни частици - микрозоми. P. Zamecnik и E. Keller (1953 - 1954) установяват, че включването на аминокиселини се засилва значително в присъствието на супернатантата при условия на регенерация на АТФ. P. Siekewitz (1952) и M. Hoagland (1956) изолират протеинова фракция (pH 5 фракция) от супернатанта, която е отговорна за рязкото стимулиране на включването на аминокиселини в микрозомите. Заедно с протеините, в супернатантата беше открит специален клас РНК с ниско молекулно тегло, сега наречени трансферни РНК (тРНК). През 1958 г. Hoagland и Zamecnik, както и P. Berg, R. Sweet и F. Allen и много други изследователи откриват, че всяка аминокиселина изисква свой собствен специален ензим, ATP, и специфична tRNA, за да бъде активирана. Стана ясно, че tRNA изпълняват изключително функцията на адаптери, т.е. устройства, които намират мястото на съответната аминокиселина в образуващата се протеинова молекула на нуклеиновата матрица (mRNA). Тези изследвания напълно потвърждават адапторната хипотеза на Ф. Крик (1957), която предвижда наличието в клетката на полинуклеотидни адаптери, необходими за правилното подреждане на аминокиселинните остатъци на синтезирания протеин върху нуклеиновата матрица. Много по-късно френският учен Ф. Чапвил (1962 г.) в лабораторията на Ф. Липман (Нобелова награда, 1953 г.) в САЩ много гениално и недвусмислено показва, че местоположението на аминокиселината в синтезираната протеинова молекула се определя изцяло от специфична тРНК, към която е прикрепен. Адаптерната хипотеза на Крик е развита в трудовете на Хогланд и Замечник.

До 1958 г. станаха известни следните основни етапи на протеиновия синтез: 1) активиране на аминокиселина от специфичен ензим от "рН 5 фракция" в присъствието на АТФ с образуването на аминоацил аденилат; 2) прикрепване на активирана аминокиселина към специфична tRNA с освобождаване на аденозин монофосфат (AMP); 3) свързване на аминоацил-тРНК (тРНК, заредена с аминокиселина) към микрозомите и включване на аминокиселини в протеин с освобождаване на тРНК. Hoagland (1958) отбелязва, че последната стъпка в протеиновия синтез изисква гуанозин трифосфат (GTP).

Трансфер РНК и генен синтез

След откриването на тРНК започват активни търсения за тяхното фракциониране и определяне на нуклеотидната последователност. Най-голям успех постига американският биохимик Р. Холи. През 1965 г. той определя структурата на аланиновата тРНК от дрожди. Използвайки рибонуклеази (гуанил РНКаза и панкреатична РНКаза), Холи разделя молекулата на нуклеиновата киселина на няколко фрагмента, определя нуклеотидната последователност във всеки от тях поотделно и след това реконструира последователността на цялата аланинова тРНК молекула. Този начин за анализ на нуклеотидната последователност се нарича блоков метод. Заслугата на Холи се състои главно в това, че той се е научил да разделя молекулата на РНК не само на малки парчета, както са правили мнозина преди него, но и на големи фрагменти (четвъртини и половини). Това му дава възможност да сглоби правилно отделни малки парчета заедно и по този начин да пресъздаде пълната нуклеотидна последователност на цялата молекула tRNA (Нобелова награда, 1968 г.).

Тази техника веднага беше приета от много лаборатории по света. През следващите две години първичната структура на няколко тРНК беше дешифрирана в СССР и в чужбина. А. А. Баев (1967) и сътрудници първи установяват нуклеотидната последователност в тРНК на валин от дрожди. Към днешна дата са изследвани повече от дузина различни отделни тРНК. Уникален рекорд в определянето на нуклеотидната последователност е поставен в Кеймбридж от F. Sanger и G. Brownlee. Тези изследователи разработиха изненадващо елегантен метод за разделяне на олигонуклеотиди и определиха последователността на така наречената 5 S (рибозомна) РНК от клетки на Escherichia coli (1968). Тази РНК се състои от 120 нуклеотидни остатъка и, за разлика от tRNA, не съдържа допълнителни второстепенни бази, които значително улесняват анализа на нуклеотидната последователност, служейки като уникални ориентири за отделните фрагменти на молекулата. В момента, благодарение на използването на метода Sanger и Brownlee, работата по изучаване на последователността на дълги рибозомни РНК и някои вирусни РНК в лабораторията на J. Ebel (Франция) и други изследователи успешно напредва.

А. А. Баев и сътрудници (1967) откриват, че разрязаната наполовина тРНК на валин възстановява своята макромолекулна структура в разтвор и въпреки дефекта в първичната структура има функционалната активност на оригиналната (нативна) молекула. Този подход - реконструиране на изрязана макромолекула след отстраняване на определени фрагменти - се оказа много обещаващ. Сега се използва широко за изясняване на функционалната роля на отделни участъци от определени тРНК.

IN последните годиниГолям успех е постигнат в получаването на кристални препарати на отделни тРНК. Сега няколко лаборатории в САЩ и Англия вече са успели да кристализират много тРНК. Това направи възможно изследването на структурата на tRNA с помощта на рентгенов дифракционен анализ. През 1970 г. Р. Бок представя първите рентгенови дифракционни модели и триизмерни модели на няколко тРНК, които създава в университета на Уисконсин. Тези модели помагат да се определи локализацията на отделните функционално активни места в тРНК и да се разберат основните принципи на функциониране на тези молекули.

От изключително значение за разкриването на механизма на синтеза на протеини и решаването на проблема за спецификата на този процес беше дешифрирането на природата на генетичния код (виж Глава 24), което без преувеличение може да се счита за водещото постижение на естествознанието. 20 век.

Откриването на Р. Холи за първичната структура на tRNA даде тласък на работата на G. Korana * (САЩ) върху синтеза на олигонуклеотиди и ги насочи към синтеза на специфична биологична структура - ДНК молекула, кодираща аланинова tRNA. Първите стъпки, предприети от Korana преди почти 15 години в химическия синтез на къси олигонуклеотиди, достигнаха кулминацията си през 1970 г. с първия извършен генен синтез. Корана и неговите сътрудници първо химически синтезираха къси фрагменти с дължина 8-12 нуклеотидни остатъка от отделни нуклеотиди. Тези фрагменти с дадена нуклеотидна последователност спонтанно образуват двойноверижни комплементарни части с припокриване от 4 - 5 нуклеотида. След това тези завършени парчета бяха съединени край до край в правилния ред с помощта на ензима ДНК лигаза. По този начин, за разлика от репликацията на ДНК молекули, според А. Корнберг ** (виж Глава 24), Корана успява да пресъздаде естествена двойноверижна ДНК молекула според предварително определена програма в съответствие с tRNA последователността, описана от Холи. По подобен начин сега се работи върху синтеза на други гени (М. Н. Колосов, З. А. Шабарова, Д. Г. Кноре, 1970 - 1975).

* (За изследване на генетичния код Г. Корана и М. Ниренберг са удостоени с Нобелова награда през 1968 г.)

** (За откриването на полимеразата и синтеза на ДНК А. Корнберг и за синтеза на РНК С. Очоа е удостоен с Нобелова награда през 1959 г.)

Микрозоми, рибозоми, транслация

В средата на 50-те години се смяташе, че микрозомите са центърът на протеиновия синтез в клетката. Терминът микрозоми е въведен за първи път през 1949 г. от A. Claude за обозначаване на фракцията от малки гранули. По-късно се оказа, че не цялата фракция микрозоми, състояща се от мембрани и гранули, а само малки рибонуклеопротеинови частици са отговорни за синтеза на протеини. Тези частици са наречени рибозоми от R. Roberts през 1958 г.

Класическите изследвания на бактериалните рибозоми са извършени от А. Тисие и Дж. Уотсън през 1958 - 1959 г. Бактериалните рибозоми се оказаха малко по-малки от растителните и животинските. J. Littleton (1960), M. Clark (1964) и E. N. Svetailo (1966) показват, че рибозомите на хлоропластите на висшите растения и митохондриите принадлежат към бактериалния тип. A. Tissier и други (1958) откриват, че рибозомите се разделят на две неравни субединици, съдържащи по една молекула РНК. В края на 50-те години се смяташе, че всяка рибозомна РНК молекула се състои от няколко къси фрагмента. Въпреки това, AS Spirin беше първият, който показа през 1960 г., че РНК в субчастиците е представена от непрекъсната молекула. D. Waller (1960), след като раздели рибозомните протеини с помощта на електрофореза с нишестен гел, установи, че те са много хетерогенни. Първоначално мнозина се съмняваха в данните на Waller, тъй като изглеждаше, че рибозомният протеин трябва да бъде строго хомогенен, като например протеина TMV. Понастоящем, в резултат на изследванията на Д. Уолър, Р. Траут, П. Трауб и други биохимици, стана известно, че съставът на самите рибозомни частици включва повече от 50 протеина, които са напълно различни по структура. През 1963 г. А. С. Спирин е първият, който разгръща рибозомни субчастици и показва, че рибозомите са компактно усукана рибонуклеопротеидна верига, която може да се разгъне при определени условия. През 1967 - 1968г М. Номура напълно реконструира биологично активната субчастица от рибозомна РНК и протеин и дори получава рибозоми, в които протеинът и РНК принадлежат на различни микроорганизми.

До ден днешен ролята на рибозомната РНК е неясна. Предполага се, че това е уникалната специфична матрица, върху която при образуването на рибозомната частица всеки от многобройните рибозомни протеини намира строго определено място (А. С. Спирин, 1968).

A. Rich (1962) открива агрегати от няколко рибозоми, свързани помежду си чрез иРНК верига. Тези комплекси се наричат ​​полизоми. Откриването на полизомите позволи на Рич и Уотсън (1963) да предположат, че синтезът на полипептидната верига се извършва върху рибозомата, която изглежда се движи по веригата на иРНК. Докато рибозомата се движи по веригата на иРНК в частицата, информацията се чете и се образува полипептидна верига на протеина, а нови рибозоми последователно се прикрепят към освободения четен край на иРНК. От данните на Рич и Уотсън следва, че важността на полизомите в клетката е в масовото производство на протеин чрез последователно четене на матрицата от няколко рибозоми наведнъж.

В резултат на изследванията на М. Ниренберг, С. Очоа, Ф. Липман, Г. Корана и др., през 1963 – 1970г. Стана известно, че наред с иРНК, рибозоми, АТФ и аминоацил-тРНК в процеса на транслация участват голям брой различни фактори, а самият процес на транслация може условно да бъде разделен на три етапа - инициация, сама транслация и терминация.

Инициирането на транслацията означава синтез на първата пептидна връзка в комплекса рибозома - матричен полинуклеотид - аминоацил-тРНК. Не всяка аминоацил-тРНК, а формилметионил-тРНК има такава инициаторна активност. Това вещество е изолирано за първи път през 1964 г. от F. Sanger и K. Marker. S. Bretcher и K. Marker (1966) показаха, че инициаторната функция на формилметионил-tRNA се дължи на нейния повишен афинитет към пептидилния център на рибозомата. Някои протеинови иницииращи фактори, които са изолирани в лабораториите на S. Ochoa, F. Gro и други изследователски центрове, също са изключително важни за началото на транслацията. След образуването на първата пептидна връзка в рибозомата започва същинската транслация, т.е. последователното добавяне на аминоацилов остатък към С-края на полипептида. Много подробности от процеса на превод са изследвани от К. Монро и Дж. Бишоп (Англия), И. Рихлик и Ф. Шорм (Чехословакия), Ф. Липман, М. Бретчър, В. Гилбърт (САЩ) и други изследователи. През 1968 г. А. С. Спирин предлага оригинална хипотеза за обяснение на механизма на рибозомата. Задвижващият механизъм, който осигурява всички пространствени движения на tRNA и mRNA по време на транслация, е периодичното отваряне и затваряне на рибозомните субчастици. Краят на транслацията е кодиран в самата матрица за четене, която съдържа стоп кодони. Както показа S. Brenner (1965 - 1967), такива кодони са триплети UAA, UAG и UGA. M. Capecchi (1967) също идентифицира специални фактори за терминиране на протеини. А. С. Спирин и Л. П. Гаврилова описват така наречения „неензимен“ протеинов синтез в рибозомите (1972 - 1975) без участието на протеинови фактори. Това откритие е важно за разбирането на произхода и еволюцията на протеиновата биосинтеза.

Регулиране на генната и протеиновата активност

След проблема за спецификата на протеиновия синтез, на първо място в молекулярната биология е проблемът за регулирането на протеиновия синтез или, което е същото, регулирането на генната активност.

Функционалното несъответствие на клетките и свързаното с това потискане и активиране на гените отдавна привличат вниманието на генетиците, но доскоро истинският механизъм за контрол на генната активност остава неизвестен.

Първите опити за обяснение на регулаторната активност на гените са свързани с изследването на хистонови протеини. Също така съпрузите Стедман * в началото на 40-те години на XX век. изрази идеята, че хистоните могат да играят основна роля в това явление. Впоследствие те получиха първите ясни данни за разликите в химическа природахистонови протеини. В момента броят на фактите в подкрепа на тази хипотеза се увеличава всяка година.

* (Е. Стедман, Е. Стедман. Основните протеини на клетъчните ядра.- Филос. прев. Рой. Soc. Лондон, 1951 г., v. 235, 565 - 595.)

В същото време се натрупва все по-голямо количество данни, което показва, че регулирането на генната активност е много по-сложен процес от простото взаимодействие на генни региони с хистонови протеинови молекули. През 1960 - 1962г в лабораторията на R. B. Khesin-Lurie беше установено, че гените на фагите започват да се четат неедновременно: гените на фаг Т2 могат да бъдат разделени на ранни гени, чието функциониране е настъпило в първите минути на инфекцията на бактериална клетка и късни гени, които започват да синтезират иРНК след завършване на работата на ранните гени.

През 1961 г. френските биохимици Ф. Якоб и Ж. Монод предлагат схема за регулиране на генната активност, която изиграва изключителна роля за разбирането на регулаторните механизми на клетките като цяло. Според схемата на Джейкъб и Моно в ДНК освен структурни (информационни) гени има и гени регулатори и гени оператори. Регулаторният ген кодира синтеза на специфично вещество - репресор, който може да бъде прикрепен както към индуктора, така и към операторния ген. Операторният ген е свързан със структурни гени, а регулаторният ген е разположен на известно разстояние от тях. Ако в околната среда няма индуктор, например лактоза, тогава репресорът, синтезиран от регулаторния ген, се свързва с операторния ген и, блокирайки го, изключва работата на целия оперон (блок от структурни гени заедно с оператора който ги контролира). При тези условия не се образува ензим. Ако в околната среда се появи индуктор (лактоза), тогава продуктът на регулаторния ген - репресорът - се свързва с лактозата и премахва блока от операторния ген. В този случай става възможна работата на структурния ген, кодиращ синтеза на ензима, и ензимът (лактоза) се появява в околната среда.

Според Джейкъб и Моно тази схема на регулиране се прилага за всички адаптивни ензими и може да възникне както по време на репресия, когато образуването на ензима е потиснато от излишък на реакционния продукт, така и по време на индукция, когато въвеждането на субстрат предизвиква синтеза на ензима. За изследванията си върху регулирането на генната активност Джейкъб и Моно получават Нобелова награда през 1965 г.

Първоначално тази схема изглеждаше твърде пресилена. По-късно обаче стана ясно, че генната регулация на този принцип се извършва не само в бактериите, но и в други организми.

От 1960 г. изследванията на организацията на генома и структурата на хроматина в еукариотните организми заемат видно място в молекулярната биология (J. Bonner, R. Britten, W. Allfrey, P. Walker, Yu. S. Chentsov, I. B. Zbarsky и др.). ) и върху регулирането на транскрипцията (А. Мирски, Г. П. Георгиев, М. Бернстиел, Д. Гол, Р. Цанев, Р. И. Салганик). Естеството на репресора остава неизвестно и противоречиво дълго време. През 1968 г. М. Пташне (САЩ) показа, че репресорът е протеин. Той го изолира в лабораторията на Дж. Уотсън и открива, че репресорът наистина има афинитет към индуктора (лактоза) и в същото време "разпознава" операторния ген на lac оперона и специфично се свързва с него.

През последните 5 - 7 години са получени данни за наличието на друга контролна клетка на генната активност - промоторната. Оказа се, че в близост до мястото на оператора, към което е прикрепен синтезираният върху гена-регулатор продукт - протеиновата субстанция на репресора, има друго място, което също трябва да се класифицира като член на регулаторната система. на генната активност. Към това място е прикрепена протеинова молекула на ензима РНК полимераза. В промоторната област трябва да се осъществи взаимно разпознаване на уникалната нуклеотидна последователност в ДНК и специфичната конфигурация на РНК полимеразния протеин. Изпълнението на процеса на четене на генетична информация с дадена последователност от гени на оперона, съседен на промотора, ще зависи от ефективността на разпознаването.

В допълнение към схемата, описана от Jacob и Monod, има и други механизми на генна регулация в клетката. F. Jacob и S. Brenner (1963) установяват, че регулацията на репликацията на бактериалната ДНК се контролира по определен начин от клетъчната мембрана. Експериментите на Джейкъб (1954) за индуциране на различни профаги убедително показаха, че под въздействието на различни мутагенни фактори в клетката на лизогенните бактерии започва селективна репликация на гена на профага и репликацията на генома на гостоприемника се блокира. През 1970 г. Ф. Бел съобщава, че малки ДНК молекули могат да преминат в цитоплазмата от ядрото и да се транскрибират там.

По този начин регулирането на генната активност може да се извърши на ниво репликация, транскрипция и транслация.

Значителен напредък е постигнат в изучаването на регулацията не само на синтеза на ензими, но и на тяхната активност. Феноменът на регулиране на ензимната активност в клетките беше посочен още през 50-те години от A. Novik и L. Szilard. G. Umbarger (1956) установи, че в клетката има много рационален начин за потискане на ензимната активност чрез крайния продукт на верига от реакции като обратна връзка. Както е установено от J. Monod, J. Changer, F. Jacob, A. Pardee и други изследователи (1956 - 1960), регулирането на ензимната активност може да се извърши според алостеричния принцип. Ензимът или една от неговите субединици, в допълнение към афинитета си към субстрата, има афинитет към един от продуктите на реакционната верига. Под въздействието на такъв сигнален продукт ензимът променя конформацията си толкова много, че губи активност. В резултат на това цялата верига от ензимни реакции се изключва в самото начало. Значителната роля на конформационните промени на протеините в ензимните реакции и в известен смисъл наличието на алостеричен ефект е посочена от D. Wiman и R. Woodward (1952; лауреат на Нобелова награда, 1965).

Структура и функция на протеините

В резултат на работата на Т. Осбърн, Г. Хофмайстер, А. Гурбер, Ф. Шулц и много други в края на 19в. Много животински и растителни протеини са получени в кристална форма. Приблизително по същото време, с помощта на различни физични методиУстановени са молекулните тегла на някои протеини. Така през 1891 г. А. Сабанеев и Н. Александров съобщават, че молекулното тегло на овалбумина е 14 000; през 1905 г. E. Reid установява, че молекулното тегло на хемоглобина е 48 000. Полимерната структура на протеините е открита през 1871 г. от G. Glasivetz и D. Haberman. Идеята за пептидните връзки на отделните аминокиселинни остатъци в протеините е изразена от Т. Курциус (1883). Работа върху химическата кондензация на аминокиселини (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano и D. Traschiatti, 1900) и синтеза на хетерополипептиди (E. Fischer, 1902 - 1907, Нобелова награда, 1902) доведе до разработването на основните принципи на химическата структура на протеините.

Първият кристален ензим (уреаза) е получен през 1926 г. от J. Sumner (Нобелова награда, 1946 г.), а през 1930 г. J. Northrop (Нобелова награда, 1946 г.) получава кристален пепсин. След тази работа стана ясно, че ензимите са протеини по природа. През 1940 г. М. Куниц изолира кристална РНКаза. До 1958 г. вече са известни повече от 100 кристални ензима и над 500 ензима, изолирани в некристална форма. Производството на високо пречистени препарати от отделни протеини допринесе за дешифрирането на тяхната първична структура и макромолекулна организация.

Голямо значениеза развитието на молекулярната биология като цяло и човешката генетика, в частност, беше откритието от L. Pauling (1940) на анормален хемоглобин S, изолиран от еритроцитите на хора с тежко наследствено заболяване - сърповидно-клетъчна анемия. През 1955 - 1957г V. Ingram използва метода на "пръстов отпечатък", разработен от F. Sanger (петна, образувани от отделни пептиди по време на хроматография върху хартия), за да анализира продуктите от хидролизата на хемоглобин S с алкали и трипсин. През 1961 г. Ingram съобщава, че хемоглобин S се различава от нормалния хемоглобин само по естеството на един аминокиселинен остатък: в нормалния хемоглобин има остатък от глутаминова киселина в седмата позиция на веригата, а в хемоглобин S има остатък от валин. Така предположението на Полинг (1949 г.), че сърповидно-клетъчната анемия е заболяване с молекулен характер, беше напълно потвърдено. Наследствена промяна само в един аминокиселинен остатък във всяка половина на макромолекулата на хемоглобина води до факта, че хемоглобинът губи способността си лесно да се разтваря при ниски концентрации на кислород и започва да кристализира, което води до нарушаване на клетъчната структура. Тези изследвания ясно показаха, че протеиновата структура е строго определена аминокиселинна последователност, която е кодирана в генома. Изключителната важност на първичната структура на протеина при образуването на уникална биологично активна конформация на макромолекула се доказва от работата на К. Анфинсен (1951). Anfinsen показа, че биологично активната макроструктура на панкреатичната рибонуклеаза, загубена в резултат на редукция, е предварително определена от аминокиселинната последователност и може да се появи отново спонтанно по време на окисляването на SH групите на цистеинови остатъци с образуването на дисулфидни напречни връзки в строго определени места в пептидната верига на ензима.

Към днешна дата механизмът на действие е проучен подробно голямо числоензими и беше определена структурата на много протеини.

През 1953 г. F. Sanger установява аминокиселинната последователност на инсулина. : Този протеин се състои от две полипептидни вериги, свързани с две дисулфидни напречни връзки. Една от веригите съдържа само 21 аминокиселинни остатъка, а другата - 30 остатъка. Sanger прекарва около 10 години в дешифриране на структурата на този сравнително прост протеин. През 1958 г. той получава Нобелова награда за това изключително изследване. След създаването на автоматичен анализатор на аминокиселини от W. Stein и S. Moore (1957), идентифицирането на продуктите на частична протеинова хидролиза се ускорява значително. Стайн и Мур вече съобщават за това през 1960 г. че са успели да определят последователността на рибонуклеазата, чиято пептидна верига е представена от 124 аминокиселинни остатъка. През същата година в лабораторията на G. Schramm в Тюбинген (Германия) F. Anderer и други определят аминокиселинната последователност в протеина TMV. След това се определя аминокиселинната последователност в миоглобина (A. Edmunson) и α- и β-веригите на човешкия хемоглобин (G. Braunitzer, E. Schroeder и др.), Лизоцим от белтък на пилешко яйце (J. Jollet, D. Кейфийлд). През 1963 г. F. Schorm и B. Keil (Чехословакия) установяват аминокиселинната последователност в молекулата на химотрипсиногена. През същата година е определена аминокиселинната последователност на трипсиногена (F. Schorm, D. Walsh). През 1965 г. К. Такахаши установява първичната структура на Т1 рибонуклеазата. След това аминокиселинните последователности бяха определени за още няколко протеина.

Както е известно, окончателното доказателство за правилността на дефиницията на определена структура е нейният синтез. През 1969 г. R. Merifield (САЩ) е първият, който извършва химичен синтез на панкреатична рибонуклеаза. Използвайки разработения от него метод за синтез на твърда фаза, Мерифийлд добавя една аминокиселина след друга към веригата в съответствие с последователността, описана от Стайн и Мур. В резултат на това той получава протеин, чиито качества са идентични с панкреатичната рибонуклеаза А. За откриването на структурата на рибонуклеазата V. Stein, S. Moore и K. Anfinsen получават Нобелова награда през 1972 г. Този синтез на естествен протеин отваря големи перспективи, което показва възможността за създаване на всякакви протеини според предварително планирана последователност.

От изследванията на рентгеновата дифракция на W. Astbury (1933) следва, че пептидните вериги на протеиновите молекули са усукани или подредени по някакъв строго определен начин. Оттогава много автори са изразили различни хипотези относно методите за сгъване на протеинови вериги, но до 1951 г. всички модели остават спекулативни конструкции, които не съответстват на експерименталните данни. През 1951 г. Л. Полинг и Р. Кори публикуват поредица от блестящи трудове, в които окончателно е формулирана теорията за вторичната структура на протеините - теорията за α-спиралата. Заедно с това стана известно също, че протеините имат и третична структура: α-спиралата на пептидната верига може да бъде сгъната по определен начин, образувайки доста компактна структура.

През 1957 г. J. Kendrew и неговите колеги за първи път предлагат триизмерен модел на структурата на миоглобина. След това този модел беше усъвършенстван в продължение на няколко години, докато окончателната работа, характеризираща пространствената структура на този протеин, се появи през 1961 г. През 1959 г. M. Perutz и сътрудници установяват триизмерната структура на хемоглобина. Изследователите са прекарали повече от 20 години в тази работа (първите рентгенови изображения на хемоглобина са получени от Perutz през 1937 г.). Тъй като молекулата на хемоглобина се състои от четири субединици, дешифрирайки нейната организация, Перуц е първият, който описва кватернерната структура на протеина. За работата си по определяне на триизмерната структура на протеините Кендрю и Перуц са удостоени с Нобелова награда през 1962 г.

ПОЗВОЛЕНО е създаването на пространствен модел на структурата на хемоглобина от Perutz. да се доближи до разбирането на механизма на функциониране на този протеин, за който е известно, че транспортира кислород в животински клетки. През 1937 г. Ф. Гауровиц стига до извода, че взаимодействието на хемоглобина с кислорода и въздуха трябва да бъде придружено от промяна в структурата на протеина. През 60-те години Перуц и колегите му откриват забележимо изместване на хемоглобиновите вериги след окисляването му, причинено от изместване на железни атоми в резултат на свързване с кислород. На тази основа се формират идеи за "дишането" на протеиновите макромолекули.

През 1960 г. Д. Филипс и неговите сътрудници започват изследвания с рентгенова дифракция на молекулата на лизозима. До 1967 г. те повече или по-малко точно установяват подробностите за организацията на този протеин и локализацията на отделните атоми в неговата молекула. В допълнение, Филипс установи естеството на добавянето на лизозим към субстрата (триацетилглюкозамин). Това направи възможно пресъздаването на механизма на действие на този ензим. По този начин познаването на първичната структура и макромолекулната организация позволи не само да се установи природата на активните центрове на много ензими, но и да се разкрие напълно механизмът на функциониране на тези макромолекули.

Използването на методи на електронна микроскопия помогна да се разкрият принципите на макромолекулната организация на такива сложни протеинови образувания като нишки от колаген, фибриноген, контрактилни мускулни фибрили и др. В края на 50-те години бяха предложени модели на мускулния контрактилен апарат. Откриването на АТФазната активност на миозина от В. А. Енгелхард и М. Н. Любимова (1939) е от изключителна важност за разбирането на механизма на мускулната контракция. Това означава, че в основата на акта на мускулна контракция е промяна във физикохимичните свойства и макромолекулната организация на контрактилния протеин под въздействието на аденозинтрифосфорна киселина (виж също глава 11).

За да се разберат принципите на сглобяване на биологични структури, вирусологичните изследвания бяха от съществено значение (вижте Глава 25).

Нерешени проблеми

Основният напредък в съвременната молекулярна биология е постигнат главно в резултат на изследването на нуклеиновите киселини. Но дори и в тази област не всички проблеми все още са решени. По-специално, дешифрирането на цялата нуклеотидна последователност на генома ще изисква големи усилия. Този проблем от своя страна е неразривно свързан с проблема за хетерогенността на ДНК и изисква разработването на нови усъвършенствани методи за фракциониране и изолиране на отделни молекули от общия генетичен материал на клетката.

Досега усилията бяха насочени главно към отделното изследване на протеини и нуклеинови киселини. В клетката тези биополимери са неразривно свързани помежду си и функционират главно под формата на нуклеопротеини. Ето защо сега необходимостта от изучаване на взаимодействието на протеини и нуклеинови киселини стана особено остра. Проблемът за разпознаването на определени участъци от нуклеинови киселини от протеини излиза на преден план. Вече са предприети стъпки за изучаване на това взаимодействие на тези биополимери, без което пълното разбиране на структурата и функциите на хромозомите, рибозомите и други структури е немислимо. Без това също е невъзможно да се разбере регулацията на генната активност и най-накрая да се дешифрират принципите на действие на механизмите за синтез на протеини. След работата на Jacob и Monod се появиха някои нови данни за регулаторното значение на мембраните в синтеза на ядрен материал. Това поставя задачата за по-задълбочено изследване на ролята на мембраните в регулацията на репликацията на ДНК. Като цяло, проблемът за регулиране на генната активност и клетъчната активност като цяло се превърна в един от най-важните проблеми на съвременната молекулярна биология.

Съвременно състояние на биофизиката

Биофизиката се развива в тясна връзка с проблемите на молекулярната биология. Интересът към тази област на биологията беше стимулиран, от една страна, от необходимостта от цялостно изследване на ефектите на различните видове радиация върху тялото, а от друга страна, от необходимостта от изучаване на физичните и физикохимичните основите на жизнените явления, протичащи на молекулярно ниво.

Получаването на точна информация за молекулярните структури и процесите, протичащи в тях, стана възможно в резултат на използването на нови фини физикохимични методи. Въз основа на постиженията на електрохимията беше възможно да се подобри методът за измерване на биоелектричните потенциали чрез използване на йон-селективни електроди (G. Eisenman, B.P. Nikolsky, Khuri, 50-60-те години). Инфрачервената спектроскопия (използвайки лазерни устройства) все повече навлиза в практиката, което позволява да се изследват конформационните промени в протеините (I. Plotnikov, 1940). Ценна информация предоставя и методът на електронния парамагнитен резонанс (E.K. Zavoisky, 1944) и биохемилуминесцентният метод (B.N. Tarusov et al., 1960), които позволяват по-специално да се прецени транспортирането на електрони по време на окислителни процеси.

До 50-те години биофизиката вече печели силна позиция. Има нужда от подготовка на квалифицирани специалисти. Ако през 1911 г. в Европа само университетът в Печ, Унгария, е имал катедра по биофизика, то през 1973 г. такива катедри съществуват в почти всички големи университети.

През 1960 г. е организирано Международното общество по биофизика. През август 1961 г. в Стокхолм се провежда първият Международен биофизичен конгрес. Вторият конгрес се провежда през 1965 г. в Париж, третият през 1969 г. в Бостън, четвъртият през 1972 г. в Москва.

В биофизиката се поддържа ясно разграничение между две области с различно съдържание - молекулярна биофизика и клетъчна биофизика. Това разграничение получава и организационен израз: създават се отделни отдели на тези две области на биофизиката. В Московския университет първата катедра по биофизика е създадена през 1953 г. във Факултета по биология и почви, а малко по-късно катедрата по биофизика възниква във Физическия факултет. Катедрите бяха организирани по същия принцип в много други университети.

Молекулярна биофизика

През последните години връзката между молекулярната биофизика и молекулярната биология става все по-силна и сега понякога може да бъде трудно да се определи къде е границата между тях. При обща атака срещу проблема с наследствената информация подобно сътрудничество между биофизиката и молекулярната биология е неизбежно.

Основното направление в изследователска работае изучаването на физиката на нуклеиновите киселини - ДНК и РНК. Използването на горните методи и преди всичко на рентгеновия дифракционен анализ допринесе за дешифрирането на молекулярната структура на нуклеиновите киселини. В момента се провеждат интензивни изследвания за изследване на поведението на тези киселини в разтвори. Особено внимание е отделено на конформационните преходи спирала-намотка, изследвани чрез промени във вискозитета, оптичните и електрическите параметри. Във връзка с изучаването на механизмите на мутагенезата се развиват изследвания за изследване на ефекта на йонизиращото лъчение върху поведението на нуклеиновите киселини в разтвори, както и ефекта на радиацията върху нуклеиновите киселини на вируси и фаги. Влиянието на ултравиолетовото лъчение, за някои спектрални области от което е известно, че се абсорбират добре от нуклеиновите киселини, беше подложено на цялостен анализ. Голям специфично теглоТози вид изследване включва откриване на активни радикали на нуклеинови киселини и протеини чрез електронен парамагнитен резонанс. Използването на този метод е свързано с появата на цяла независима посока.

Проблемът с кодирането на ДНК и РНК информацията и нейното предаване по време на протеиновия синтез отдавна е от интерес за молекулярната биофизика и физиците многократно са изразявали определени съображения по този въпрос (Е. Шрьодингер, Г. Гамов). Дешифрирането на генетичния код е породило множество теоретични и експериментални изследваниявърху структурата на спиралата на ДНК, механизма на плъзгане и усукване на нейните нишки, върху изучаването на физическите сили, участващи в тези процеси.

Молекулярната биофизика оказва значителна помощ на молекулярната биология при изучаването на структурата на протеиновите молекули с помощта на рентгенов дифракционен анализ, използван за първи път през 1930 г. от J. Bernal. Именно в резултат на използването на физични методи в комбинация с биохимични (ензимни методи) бяха разкрити молекулярната конформация и последователността на аминокиселините в редица протеини.

Съвременните изследвания с електронна микроскопия, които разкриват наличието на сложни мембранни системи в клетките и техните органели, стимулират опитите за разбиране на тяхната молекулна структура (вижте глави 10 и 11). Изучава се интравиталния химичен състав на мембраните и по-специално свойствата на техните липиди. Установено е, че последните са способни на реакции на пероксидация и неензимни верижни окислителни реакции (Ю. А. Владимиров и Ф. Ф. Литвин, 1959; Б. Н. Тарусов и др., 1960; И. И. Иванов, 1967), което води до нарушаване на мембранните функции. За изследване на състава на мембраните са използвани и методи на математическо моделиране (В. Ц. Пресман, 1964 - 1968; М. М. Шемякин, 1967; Ю. А. Овчинников, 1972).

Клетъчна биофизика

Значително събитие в историята на биофизиката беше формирането през 50-те години на ясни идеи за термодинамиката на биологичните процеси, в резултат на което предположенията за възможността за независимо образуване на енергия в живите клетки, противно на втория закон на термодинамиката, бяха окончателно елиминирани. Разбирайки действието на този закон в биологични системисвързано с въвеждането от белгийския учен И. Пригожин (1945) * в биологичната термодинамика на концепцията отворени системи, обменяйки енергия и материя с външната среда. Пригожин показа, че положителната ентропия се образува в живите клетки по време на работните процеси в съответствие с втория закон на термодинамиката. Въведените от него уравнения определят условията, при които възниква т. нар. стационарно състояние (по-рано се наричаше още динамично равновесие), при което количеството свободна енергия (негентропия), постъпваща в клетките с храната, компенсира нейното потребление, а положителната ентропия е отстранени. Това откритие затвърди общата биологична идея за неразривната връзка между външните и вътрешна средаклетки. Той постави основата за истинско изследване на термодинамиката на живите системи, включително метода на моделиране (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).

* (Обща теорияотворените системи са представени за първи път от Л. Берталанфи през 1932 г.)

Според основния принцип на биотермодинамиката, необходимо условие за съществуването на живота е стационарността в развитието на неговите биохимични процеси, за осъществяването на които е необходимо съгласуване на скоростите на множество метаболитни реакции. Въз основа на новата биофизична термодинамика се появи посока, която идентифицира външни и вътрешни фактори, които осигуряват тази координация на реакциите и я правят стабилна. През последните две десетилетия е разкрита основна роля в поддържането на стационарно състояние на системата от инхибитори и особено антиоксиданти (B.N. Tarusov и A.I. Zhuravlev, 1954, 1958). Установено е, че надеждността на стационарното развитие е свързана с факторите на околната среда (температура) и физични и химични свойстваклетъчна среда.

Съвременните принципи на биотермодинамиката позволиха да се даде физична и химическа интерпретация на механизма на адаптация. Според нашите данни, адаптирането към условията на околната среда може да възникне само ако, когато се променят, организмът е в състояние да установи стационарност в развитието на биохимичните реакции (B. N. Tarusov, 1974). Възникна въпросът за разработването на нови методи, които биха позволили оценка на стационарното състояние интравитално и прогнозиране на възможните му нарушения. Въвеждането на кибернетичните принципи на саморегулиращите се системи в биотермодинамиката и изследването на процесите на биологична адаптация обещава големи ползи. Стана ясно, че за решаване на проблема със стабилността на стационарното състояние е важно да се вземат предвид така наречените смущаващи фактори, които включват по-специално неензимни реакции на окисление на липидите. Напоследък все повече се разширяват изследванията на процесите на пероксидация в липидните фази на живите клетки и растежа на активни радикални продукти, които нарушават регулаторните функции на мембраните. Източникът на информация за тези процеси е откриването на активни пероксидни радикали и пероксидни съединения на биолипидите (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; E. B. Burlakova, 1967 и др.). За откриване на радикали се използва биохемилуминесценция, която възниква в липидите на живите клетки по време на тяхната рекомбинация.

Въз основа на физикохимичните идеи за стабилността на стационарното състояние възникнаха биофизичните идеи за адаптирането на растенията към промените в условията на околната среда като нарушение на инхибиторните антиоксидантни системи (Б. Н. Тарусов, Я. Е. Доскоч, Б. М. Китлаев, А. М. Агавердиев , 1968 - 1972). Това отвори възможността за оценка на свойства като устойчивост на замръзване и устойчивост на сол, както и за правене на подходящи прогнози при отглеждане на селскостопански растения.

През 50-те години е открито ултраслабо сияние - биохемолуминесценция на редица биологични обекти във видимата и инфрачервената част на спектъра (Б. Н. Тарусов, А. И. Журавлев, А. И. Поливода). Това стана възможно в резултат на разработването на методи за записване на ултраслаби светлинни потоци с помощта на фотоумножители (Л. А. Кубецки, 1934 г.). Като резултат от биохимични реакции, протичащи в жива клетка, биохемилуминесценцията дава възможност да се преценят важни окислителни процеси във веригите за пренос на електрони между ензимите. Откриването и изследването на биохемилуминесценцията има големи теоретични и практическо значение. Така Б. Н. Тарусов и Ю. Б. Кудряшов отбелязват голямата роля на продуктите на окисление на ненаситените мастни киселини в механизма на възникване на патологични състояния, развиващи се под въздействието на йонизиращо лъчение, по време на канцерогенеза и други нарушения на нормалните клетъчни функции.

През 50-те години поради бурното разв ядрена физикаРадиобиологията, която изучава биологичните ефекти на йонизиращото лъчение, възниква от биофизиката. Получаване на изкуствени радиоактивни изотопи, създаване термоядрени оръжия, ядрени реактори и развитието на други форми практическа употреба атомна енергияповдигна с цялата си спешност проблема за защитата на организмите от вредното въздействие на йонизиращото лъчение, разработвайки теоретични основи за профилактика и лечение на лъчева болест. За да направите това, беше необходимо преди всичко да разберете кои клетъчни компоненти и метаболитни връзки са най-уязвими.

Обектът на изследване на биофизиката и радиобиологията беше да се изясни природата на първичните химични реакции, протичащи в живите субстрати под въздействието на радиационна енергия. Тук беше важно не само да разберем механизмите на това явление, но и да можем да повлияем на процеса на обмен на физическа енергия за химическа енергия и да намалим коефициента му на „полезно“ действие. Работата в тази насока е инициирана от изследванията на школата на Н. Н. Семенов (1933) в СССР и Д. Хиншелуд (1935) в Англия.

Голямо място в радиобиологичните изследвания е заето от изучаването на степента на радиационна устойчивост на различни организми. Установено е, че повишената радиорезистентност (например пустинни гризачи) се дължи на високата антиоксидантна активност на липидите на клетъчната мембрана (M. Chang et al., 1964; N.K. Ogryzov et al., 1969). Оказа се, че токоферолите, витамин К и тио съединенията играят важна роля във формирането на антиоксидантните свойства на тези системи (I. I. Ivanov et al., 1972). През последните години изследванията върху механизмите на мутагенезата също привлякоха голямо внимание. За тази цел се изследва влиянието на йонизиращото лъчение върху поведението на нуклеиновите киселини и протеините in vitro, както и във вирусите и фагите (A. Gustafson, 1945 - 1950).

Борба за допълнително увеличениеефективността на химическата защита, търсенето на по-ефективни инхибитори и принципите на инхибиране остават основните задачи на биофизиката в тази посока.

Напредва изучаването на възбудените състояния на биополимерите, които обуславят тяхната висока химична активност. Най-успешните изследвания са проведени върху възбудени състояния, които възникват в първичния етап на фотобиологичните процеси - фотосинтеза и зрение.

По този начин е направен солиден принос за разбирането на първичното активиране на молекулите на растителните пигментни системи. Установено е голямото значение на преноса (миграцията) на енергия от възбудени състояния без загуба от активирани пигменти към други субстрати. Голяма роля в развитието на тези идеи изиграха теоретичните трудове на А. Н. Теренин (1947 г. и по-късно). A. A. Krasnovsky (1949) открива и изследва реакцията на обратима фотохимична редукция на хлорофила и неговите аналози. Сега има общо убеждение, че в близко бъдеще ще бъде възможно да се възпроизведе фотосинтезата при изкуствени условия (виж също Глава 5).

Биофизиците продължават да работят, за да разкрият естеството на мускулната контракция и механизмите на нервно възбуждане и проводимост (виж Глава 11). Актуално значение придобиха и изследванията на механизмите на преход от възбудено състояние към нормално състояние. Сега възбуденото състояние се разглежда като резултат от автокаталитична реакция, а инхибирането като следствие от рязка мобилизация на инхибиторната антиоксидантна активност в резултат на молекулярни пренареждания в съединения като токоферол (I.I. Ivanov, O.R. Kols, 1966; O.R. Kols, 1970).

Най-важният общ проблем на биофизиката остава познаването на качествените физични и химични характеристики на живата материя. Свойства като способността на живите биополимери селективно да свързват калия или да поляризират електричество, не може да се запази дори при най-внимателно отстраняване от тялото. Ето защо клетъчната биофизика продължава интензивно да разработва критерии и методи за прижизнено изследване на живата материя.

Въпреки младостта на молекулярната биология, успехите, постигнати в тази област, са наистина зашеметяващи. За сравнително кратък период от време е установена природата на гена и основните принципи на неговата организация, възпроизвеждане и функциониране. Освен това е извършено не само размножаване на гени in vitro, но и за първи път е завършен пълен синтез на самия ген. Напълно е дешифриран генетичният код и е решен най-важният биологичен проблем за спецификата на биосинтезата на протеини. Идентифицирани и проучени са основните пътища и механизми на образуване на протеини в клетката. Първичната структура на много транспортни РНК - специфични адапторни молекули, които превеждат езика на нуклеиновите матрици на езика на аминокиселинната последователност на синтезирания протеин - е напълно определена. Аминокиселинната последователност на много протеини е напълно дешифрирана и е установена пространствената структура на някои от тях. Това позволи да се изяснят принципът и детайлите на функционирането на ензимните молекули. Извършен е химичен синтез на един от ензимите рибонуклеаза. Установени са основните принципи на организация на различни субклетъчни частици, много вируси и фаги и са разкрити основните пътища на тяхната биогенеза в клетката. Разкрити са подходи за разбиране на начините за регулиране на генната активност и изясняване на регулаторните механизми на живота. Вече прост списък на тези открития показва, че втората половина на 20 век. бе белязан от огромен напредък в биологията, който се дължи преди всичко на задълбочено изследване на структурата и функциите на биологично важни макромолекули - нуклеинови киселини и протеини.

Постиженията на молекулярната биология вече се използват в практиката и дават осезаеми резултати в медицината, селското стопанство и някои индустрии. Няма съмнение, че въздействието на тази наука ще нараства всеки ден. Основният резултат обаче все пак трябва да се счита, че под влиянието на успехите на молекулярната биология се засили увереността в съществуването на неограничени възможности по пътя към разкриването на най-съкровените тайни на живота.

В бъдеще, очевидно, ще бъдат открити нови пътища за изследване на биологичната форма на движение на материята - от молекулярно ниво биологията ще премине към атомно ниво. Сега обаче може би няма нито един изследовател, който да може реалистично да предвиди развитието на молекулярната биология дори за следващите 20 години.

Можем да кажем, че молекулярната биология изучава проявите на живота върху неживи структури или системи с елементарни признаци на жизнена активност (които могат да бъдат отделни биологични макромолекули, техни комплекси или органели), изучавайки как ключовите процеси, характеризиращи живата материя, се осъществяват чрез химични взаимодействия и трансформации.

Разделяне на молекулярната биология от биохимията в независим регионнауката е продиктувана от факта, че нейната основна задача е да изучава структурата и свойствата на биологичните макромолекули, участващи в различни процеси, и да изяснява механизмите на тяхното взаимодействие. Биохимията се занимава с изучаването на действителните процеси на живота, моделите на тяхното протичане в живия организъм и трансформациите на молекулите, които съпътстват тези процеси. В крайна сметка молекулярната биология се опитва да отговори на въпроса защо възниква определен процес, докато биохимията отговаря на въпросите къде и как от химическа гледна точка се случва въпросният процес.

История

Молекулярната биология като отделен клон на биохимията започва да се оформя през 30-те години на миналия век. Именно тогава, за по-задълбочено разбиране на феномена на живота, възниква необходимостта от целенасочени изследвания на молекулярно ниво на процесите на съхранение и предаване на наследствена информация в живите организми. Тогава задачата на молекулярната биология се определя в изучаването на структурата, свойствата и взаимодействието на нуклеиновите киселини и протеините. Терминът „молекулярна биология“ е използван за първи път от английския учен Уилям Астбъри в контекста на изследвания, свързани с изясняване на връзките между молекулярната структура и физическите и биологични свойствафибриларни протеини като колаген, кръвен фибрин или мускулни контрактилни протеини.

В ранните дни на молекулярната биология РНК се смяташе за компонент на растенията и гъбите, а ДНК се смяташе за типичен компонент на животинските клетки. Първият изследовател, който доказва, че ДНК се съдържа в растенията, е Андрей Николаевич Белозерски, който изолира ДНК на грах през 1935 г. Това откритие установява факта, че ДНК е универсална нуклеинова киселина, присъстваща в растителни и животински клетки.

Голямо постижение е установяването от Джордж Бийдъл и Едуард Тейтъм на пряка причинно-следствена връзка между гените и протеините. В своите експерименти те излагат клетки на Neurospora ( Невроспоракрасса) Рентгеново лъчение, което причинява мутации. Получените резултати показват, че това води до промени в свойствата на специфични ензими.

През 1940 г. Алберт Клод изолира гранули, съдържащи цитоплазмена РНК, от цитоплазмата на животински клетки, които са по-малки от митохондриите. Той ги нарече микрозоми. Впоследствие при изследване на структурата и свойствата на изолираните частици се установява тяхната фундаментална роля в процеса на биосинтеза на протеини. През 1958 г. на първия симпозиум, посветен на тези частици, беше решено тези частици да бъдат наречени рибозоми.

Друга важна стъпка в развитието на молекулярната биология са публикуваните през 1944 г. данни от експеримента на Осуалд ​​Ейвъри, Колин Маклауд и Маклийн Маккарти, които показват, че ДНК е причината за бактериалната трансформация. Това беше първото експериментално доказателство за ролята на ДНК в предаването на наследствена информация, развенчавайки преобладаващата преди това идея за протеиновата природа на гените.

В началото на 50-те години на миналия век Фредерик Сангер показа, че протеиновата верига е уникална последователност от аминокиселинни остатъци. В края на 50-те години Макс Перуц и Джон Кендрю дешифрираха пространствената структура на първите протеини. Още през 2000 г. бяха известни стотици хиляди естествени аминокиселинни последователности и хиляди пространствени структури на протеини.

Приблизително по същото време изследванията на Ервин Чаргаф му позволяват да формулира правила, описващи съотношението на азотните бази в ДНК (правилата гласят, че независимо от видовите различия в ДНК, количеството гуанин е равно на количеството цитозин и количеството на аденин е равен на количеството темин), което по-късно спомага за най-големия пробив в молекулярната биология и едно от най-големите открития в биологията изобщо.

Това събитие се случи през 1953 г., когато Джеймс Уотсън и Франсис Крик, базирани на творбите на Розалинд Франклин и Морис Уилкинс Рентгеноструктурен анализДНК, установява двойноверижната структура на ДНК молекулата. Това откритие даде възможност да се отговори на основния въпрос за способността на носителя на наследствена информация да се самовъзпроизвежда и да се разбере механизмът на предаване на такава информация. Същите тези учени формулират принципа на комплементарност на азотните основи, който е от ключово значение за разбирането на механизма на образуване на надмолекулни структури. Този принцип, който сега се използва за описание на всички молекулни комплекси, ни позволява да опишем и предвидим условията за възникване на слаби (невалентни) междумолекулни взаимодействия, които определят възможността за образуване на вторични, третични и т.н. структурата на макромолекулите, хода на самосглобяване на супрамолекулни биологични системи, които определят толкова голямо разнообразие от молекулярни структури и техните функционални комплекти. По същото време през 1953 г. възниква научното списание Journal of Molecular Biology. Той беше ръководен от Джон Кендрю, чиято област на научни интереси беше изследването на структурата на глобуларните протеини (Нобелова награда през 1962 г. заедно с Макс Перуц). Подобно рускоезично списание, наречено „Молекулярна биология“, е основано в СССР от В. А. Енгелхард през 1966 г.

През 1958 г. Франсис Крик формулира т.нар. централната догма на молекулярната биология: идеята за необратимостта на потока на генетична информация от ДНК през РНК към протеини по схемата ДНК → ДНК (репликация, създаване на копие на ДНК), ДНК → РНК ( транскрипция, копиране на гени), РНК → протеин (транслация, декодиране на информация за структурата на протеините). Тази догма е коригирана донякъде през 1970 г., като се вземат предвид натрупаните знания, тъй като феноменът на обратната транскрипция е открит независимо от Хауърд Темин и Дейвид Балтимор: открит е ензим, reversease, който е отговорен за обратната транскрипция - образуването на двойно- усукана ДНК върху едноверижна РНК матрица, която се среща в онкогенните вируси. Трябва да се отбележи, че строгото изискване за потока на генетична информация от нуклеиновите киселини към протеините все още остава в основата на молекулярната биология.

През 1957 г. Александър Сергеевич Спирин, заедно с Андрей Николаевич Белозерски, показват, че въпреки значителните разлики в нуклеотидния състав на ДНК от различни организми, съставът на общата РНК е подобен. Въз основа на тези данни те стигнаха до сензационното заключение, че общата РНК на клетката не може да действа като носител на генетична информация от ДНК към протеини, тъй като не съвпада с нея по състав. В същото време те забелязаха, че има малка част от РНК, която напълно съответства по своя нуклеотиден състав на ДНК и която може да бъде истински носител на генетична информация от ДНК към протеини. В резултат на това те предсказаха съществуването на сравнително малки РНК молекули, които са аналогични по структура на отделни участъци от ДНК и действат като посредници при трансфера на генетична информация, съдържаща се в ДНК, към рибозомата, където протеиновите молекули се синтезират с помощта на тази информация. През 1961 г. (S. Brenner, F. Jacob, M. Meselson от една страна и F. Gros, Francois Jacob и Jacques Monod са първите, които получават експериментално потвърждение за съществуването на такива молекули - информационна (информационна) РНК. в същото време те разработиха концепцията и модела на функционалната единица на ДНК - оперон, което направи възможно да се обясни как точно се извършва регулацията на генната експресия в прокариотите.Изследване на механизмите и принципите на биосинтеза на протеини структурна организацияи работата на молекулярните машини - рибозомите - направи възможно формулирането на постулат, описващ движението на генетичната информация, наречен централната догма на молекулярната биология: ДНК - иРНК - протеин.

През 1961 г. и през следващите няколко години Хайнрих Матай и Маршал Ниренберг, а след това Хар Корана и Робърт Холи извършват няколко работи за дешифриране на генетичния код, в резултат на което се установява пряка връзка между структурата на ДНК и синтезирани протеини и нуклеотидната последователност, която определя набор от аминокиселини в протеин. Получени са и данни за универсалността на генетичния код. Откритията бяха отбелязани Нобелова награда 1968 г.

За развитието на съвременните идеи за функциите на РНК решаващо беше откриването на некодиращи РНК, базирано на резултатите от работата на Александър Сергеевич Спирин заедно с Андрей Николаевич Белозерски през 1958 г., Чарлз Бренер и съавтори и Саул Шпигелман през 1961г. Този тип РНК съставлява по-голямата част от клетъчната РНК. Некодиращите РНК включват предимно рибозомни РНК.

Методите за култивиране и хибридизиране на животински клетки са получили значително развитие. През 1963 г. Франсоа Джейкъб и Сидни Бренер формулират идеята за репликон - последователност от присъщи репликиращи се гени, която обяснява важни аспекти на регулирането на генната репликация.

През 1967 г. в лабораторията на А. С. Спирин за първи път беше демонстрирано, че формата на компактно нагъната РНК определя морфологията на рибозомната частица.

През 1968 г. е направено значително фундаментално откритие. Okazaki, след като открива ДНК фрагменти от изоставащата верига, докато изучава процеса на репликация, наименува Okazaki фрагменти след нея, изяснява механизма на репликация на ДНК.

През 1970 г. Хауърд Темин и Дейвид Балтимор независимо един от друг правят важно откритие: те откриват ензима ревертаза, който е отговорен за обратната транскрипция - образуването на двойноверижна ДНК върху едноверижна РНК матрица, което се среща в онкогенни вируси, съдържащи РНК.

Друго важно постижение на молекулярната биология е обяснението на механизма на мутациите на молекулярно ниво. В резултат на поредица от изследвания бяха установени основните видове мутации: дупликации, инверсии, делеции, транслокации и транспозиции. Това направи възможно разглеждането на еволюционните промени от гледна точка на генните процеси и направи възможно разработването на теорията за молекулярните часовници, която се използва във филогенезата.

До началото на 70-те години бяха формулирани основните принципи на функциониране на нуклеиновите киселини и протеините в живия организъм. Установено е, че протеините и нуклеиновите киселини в тялото се синтезират с помощта на матричен механизъм; матричната молекула носи криптирана информация за последователността на аминокиселините (в протеина) или нуклеотидите (в нуклеиновата киселина). По време на репликация (дупликация на ДНК) или транскрипция (синтез на иРНК), ДНК служи като такава матрица; по време на транслация (синтез на протеин) или обратна транскрипция, иРНК служи като такава матрица.

По този начин бяха създадени теоретични предпоставки за развитието на приложни области на молекулярната биология, по-специално на генното инженерство. През 1972 г. Пол Берг, Хърбърт Боер и Стенли Коен разработват технология за молекулярно клониране. Тогава те първи получиха рекомбинантна ДНК in vitro. Тези изключителни експерименти поставиха основите на генното инженерство и тази година се счита за рождена дата на тази научна област.

През 1977 г. Фредерик Сангер и независимо Алън Максам и Уолтър Гилбърт разработват различни методи за определяне на първичната структура (секвениране) на ДНК. Методът Sanger, така нареченият метод за прекъсване на веригата, е в основата на съвременното секвениране. Принципът на секвениране се основава на използването на белязани бази, които действат като терминатори в реакция на кръгово секвениране. Този метод стана широко разпространен поради способността си за бързо извършване на анализ.

1976 - Фредерик. Sanger дешифрира нуклеотидната последователност на ДНК на фага φΧ174 с дължина 5375 нуклеотидни двойки.

1981 г. – Сърповидно-клетъчната болест става първото генетично заболяване, диагностицирано чрез ДНК тестове.

1982-1983 г. откриването на каталитичната функция на РНК в американските лаборатории на Т. Чек и С. Алтман промени съществуващата идея за изключителната роля на протеините. По аналогия с каталитичните протеини - ензими, каталитичните РНК бяха наречени рибозими.

1987 Keri Mullez открива полимеразната верижна реакция, благодарение на която е възможно изкуствено да се увеличи значително броят на ДНК молекулите в разтвор за по-нататъшна работа. Днес това е един от най-важните методи на молекулярната биология, използван при изследване на наследствени и вирусни заболявания, при изследване на гени и при генетична идентификация на идентичност и родство и др.

През 1990 г. три групи учени едновременно публикуват метод, който дава възможност за бързо получаване на синтетична функционално активна РНК (изкуствени рибозими или молекули, които взаимодействат с различни лиганди - аптамери) в лаборатория. Този метод се нарича „еволюция ин витро“. И скоро след това, през 1991-1993 г. в лабораторията на А.Б. Quadruple експериментално демонстрира възможността за съществуване, растеж и амплификация на РНК молекули под формата на колонии върху твърда среда.

През 1998 г., почти едновременно, Крейг Мело и Андрю Файър описаха механизъм, наблюдаван преди това по време на генни експерименти с бактерии и цветя РНК интерференция, при което малка двуверижна РНК молекула води до специфично потискане на генната експресия.

Откриването на механизма на РНК интерференцията има много важно практическо значение за съвременната молекулярна биология. Този феномен се използва широко в научните експерименти като инструмент за „изключване“, тоест потискане на експресията на отделни гени. От особен интерес е фактът, че този метод позволява обратимо (временно) потискане на активността на изследваните гени. Провеждат се изследвания за възможността за използване на този феномен за лечение на вирусни, туморни, дегенеративни и метаболитни заболявания. Трябва да се отбележи, че през 2002 г. бяха открити мутантни полиомиелитни вируси, които успяха да избегнат РНК интерференция, така че е необходима по-усърдна работа, за да се разработи наистина ефективни методилечение, базирано на този феномен.

През 1999-2001 г. няколко групи изследователи определят структурата на бактериалната рибозома с разделителна способност от 5,5 до 2,4 ангстрьома.

Вещ

Постиженията на молекулярната биология в познаването на живата природа са трудни за надценяване. Голям успех е постигнат благодарение на успешна изследователска концепция: сложните биологични процеси се разглеждат от гледна точка на отделни молекулярни системи, което позволява използването на прецизни физикохимични методи за изследване. Това привлече и много велики умове от сродни области в тази област на науката: химия, физика, цитология, вирусология, което също имаше благоприятен ефект върху мащаба и скоростта на развитие на научните знания в тази област. Такива значими открития като определяне на структурата на ДНК, дешифриране на генетичния код и изкуствено насочена модификация на генома позволиха значително по-добре да се разберат спецификите на процесите на развитие на организмите и успешно да се решат множество важни фундаментални и приложни научни, медицински и социални проблеми, които не толкова отдавна се смятаха за неразрешими.

Предмет на изучаване на молекулярната биология са основно протеини, нуклеинови киселини и молекулярни комплекси (молекулярни машини) на тяхна основа и процесите, в които участват.

Нуклеиновите киселини са линейни полимери, състоящи се от нуклеотидни единици (съединения на петчленна захар с фосфатна група при петия атом на цикъла и една от четирите азотни бази), свързани помежду си чрез естерна връзка от фосфатни групи. Така нуклеиновата киселина е пентозофосфатен полимер с азотни основи като странични заместители. Химичен съставРНК веригите се различават от ДНК по това, че първата се състои от петчленен цикъл на въглехидратната рибоза, докато втората се състои от производно на дехидроксирибоза, дезоксирибоза. Освен това пространствено тези молекули се различават радикално, тъй като РНК е гъвкава едноверижна молекула, докато ДНК е двойноверижна молекула.

Протеините са линейни полимери, които представляват вериги от алфа аминокиселини, свързани помежду си с пептидни връзки, откъдето идва и второто им име – полипептиди. Естествените протеини съдържат много различни аминокиселинни единици - до 20 при хората - което определя голямо разнообразие от функционални свойства на тези молекули. Определени протеини участват в почти всеки процес в тялото и изпълняват много задачи: те играят ролята на клетъчни строителен материал, осигуряват транспорт на вещества и йони, катализират химични реакции - този списък е много дълъг. Протеините образуват стабилни молекулярни конформации на различни нива на организация (вторични и третични структури) и молекулярни комплекси, което допълнително разширява тяхната функционалност. Тези молекули могат да имат висока специфичност за изпълнение на определени задачи поради образуването на сложна пространствена глобуларна структура. Голямото разнообразие от протеини осигурява постоянния интерес на учените към този тип молекули.

Съвременните идеи за предмета на молекулярната биология се основават на обобщение, представено за първи път през 1958 г. от Франсис Крик като централна догма на молекулярната биология. Неговата същност беше твърдението, че генетичната информация в живите организми преминава през строго определени етапи на внедряване: копиране от ДНК в ДНК на входа на наследството, от ДНК в РНК и след това от РНК в протеин, като обратният преход не е възможен. Това твърдение беше само отчасти вярно, така че централната догма впоследствие беше коригирана с оглед на новите данни, които се появиха.

На този моментИзвестни са няколко начина за реализация на генетичен материал, представляващи различни последователности от три вида съществуване на генетична информация: ДНК, РНК и протеин. В девет възможни начина на изпълнение се разграничават три групи: това са три общи трансформации (генерални), които се срещат нормално в повечето живи организми; три специални трансформации (спец.), извършени в някои вируси или в спец лабораторни условия; три неизвестни трансформации (неизвестни), изпълнението на които се счита за невъзможно.

Общите трансформации включват следване на пътекиизпълнение на генетичния код: ДНК→ДНК (репликация), ДНК→РНК (транскрипция), РНК→протеин (транслация).

За да извършат предаването на наследствени характеристики, родителите трябва да предадат пълна ДНК молекула на своите потомци. Процесът, чрез който може да се синтезира точно копие от оригиналната ДНК и следователно може да се прехвърли генетичен материал, се нарича репликация. Осъществява се от специални протеини, които разплитат молекулата (изправят нейния участък), развиват двойната спирала и с помощта на ДНК полимераза създават точно копие на оригиналната ДНК молекула.

За да осигури живота на една клетка, тя трябва постоянно да се обръща към генетичния код, вграден в двойната спирала на ДНК. Въпреки това, тази молекула е твърде голяма и тромава, за да бъде използвана като директен източник на генетичен материал за непрекъснат протеинов синтез. Следователно в процеса на внедряване на информацията, съдържаща се в ДНК, има междинен етап: синтеза на иРНК, която е малка едноверижна молекула, комплементарна на определен сегмент от ДНК, кодиращ определен протеин. Процесът на транскрипция се осъществява от РНК полимераза и транскрипционни фактори. След това получената молекула може лесно да бъде доставена до частта от клетката, отговорна за протеиновия синтез - рибозомата.

След като РНК навлезе в рибозомата, започва последният етап на внедряване на генетичната информация. В този случай рибозомата чете генетичния код от иРНК в триплети, наречени кодони и синтезира съответния протеин въз основа на получената информация.

По време на специални трансформации генетичният код се изпълнява по схемата РНК→РНК (репликация), РНК→ДНК (обратна транскрипция), ДНК→протеин (директна транслация). Репликацията от този тип се среща в много вируси, където се осъществява от ензима РНК-зависима РНК полимераза. Подобни ензими се намират в еукариотните клетки, където те са свързани с процеса на заглушаване на РНК. Обратната транскрипция се среща при ретровирусите, където се осъществява под действието на ензим обратна транскриптаза, а също и в някои случаи в еукариотни клетки, например по време на теломерния синтез. Излъчването на живо се извършва само в изкуствени условия в изолирана система извън клетката.

Всеки от трите възможни прехода на генетична информация от протеин към протеин, РНК или ДНК се счита за невъзможен. Случаят на ефекта на прионите върху протеините, в резултат на който се образува подобен прион, може условно да се припише на вида на внедряване на генетична информация протеин → протеин. Формално обаче не е такъв, тъй като не засяга аминокиселинната последователност в протеина.

Интересна е историята на произхода на термина „централна догма“. Тъй като думата догма обикновено означава твърдение, което е извън съмнение, а самата дума има ясни религиозни конотации, избирайки я като описание научен фактне съвсем законно. Според самия Франсис Крик това е неговата грешка. Той искаше да придаде на предложената теория по-голямо значение, да я разграничи от други теории и хипотези; Защо реши да използва тази величествена, според него, дума, без да разбере истинското й значение? Името обаче остана.

Молекулярната биология днес

Бързото развитие на молекулярната биология, постоянният обществен интерес към напредъка в тази област и обективното значение на изследванията доведоха до появата на голям брой големи изследователски центрове по молекулярна биология по света. Сред най-големите трябва да се посочат: Лабораторията по молекулярна биология в Кеймбридж, Кралският институт в Лондон - във Великобритания; институти по молекулярна биология в Париж, Марсилия и Страсбург, Институт Пастьор – във Франция; катедри по молекулярна биология в Харвардския университет и Масачузетския технологичен институт, Университета Бъркли, Калифорнийския технологичен институт, Университета Рокфелер и Здравния институт Бетесда – в САЩ; Институти Макс Планк, Университети в Гьотинген и Мюнхен, Централен институт по молекулярна биология в Берлин, Институти в Йена и Хале – в Германия; Каролинска институт в Стокхолм, Швеция.

В Русия водещи центрове в тази област са Институтът по молекулярна биология на името на. V.A. Engelhardt RAS, Институт по молекулярна генетика RAS, Институт по генна биология RAS, Институт по физико-химическа биология на името на. А. Н. Белозерски Московски държавен университет на името на. М. В. Ломоносов, Институт по биохимия на името на. A.N.Bach RAS и Института по протеин RAS в Пущино.

Днес интересите на молекулярните биолози обхващат широк спектър от фундаментални научни въпроси. Водещата роля все още се заема от изследването на структурата на нуклеиновите киселини и биосинтезата на протеини, изследването на структурата и функциите на различни вътреклетъчни структури и клетъчни повърхности. Също така важни области на изследване са изучаването на механизмите на приемане и предаване на сигнала, молекулярните механизми на транспорт на съединения в клетката, а също и от клетката към външна средаи обратно. Сред основните направления на научните изследвания в областта на приложната молекулярна биология един от най-приоритетните е проблемът за възникването и развитието на туморите. Също така много важна област, която се изучава от клона на молекулярната биология - молекулярната генетика, е изучаването на молекулярните основи на появата на наследствени заболявания и вирусни заболявания, например СПИН, както и разработването на методи за тяхното профилактика и евентуално лечение на генно ниво. Откритията и разработките на молекулярните биолози в съдебната медицина са намерили широко приложение. Истинска революция в областта на личната идентификация беше направена през 80-те години от учени от Русия, САЩ и Великобритания благодарение на разработването и внедряването в ежедневната практика на метода „геномен пръстов отпечатък“ - идентифициране на индивид по ДНК. Изследванията в тази област продължават и до днес. съвременни методипозволяват идентификация с вероятност за грешка от една милиардна от процента. Вече е в ход активно разработване на проект за генетичен паспорт, който се очаква значително да намали престъпността.

Методика

Днес молекулярната биология разполага с обширен арсенал от методи, които й позволяват да решава най-напредналите и най-сложни проблеми, пред които са изправени учените.

Един от най-разпространените методи в молекулярната биология е гел електрофореза, което решава проблема с разделянето на смес от макромолекули по размер или заряд. Почти винаги след разделяне на макромолекули в гел се използва блотиране, метод, който позволява макромолекулите да бъдат прехвърлени от гела (сорбирани) към повърхността на мембраната за удобство на по-нататъшна работа с тях, по-специално хибридизация. Хибридизацията е образуването на хибридна ДНК от две вериги, имащи различно естество, е метод, който играе важна роля в фундаментални изследвания. Използва се за определяне допълващи сесегменти в различна ДНК (ДНК на различни видове), използва се за търсене на нови гени, с негова помощ е открита РНК интерференция и принципът му е в основата на геномния пръстов отпечатък.

Основна роля в съвременната практика на молекулярно-биологичните изследвания играе методът на секвениране – определяне на последователността на нуклеотидите в нуклеиновите киселини и аминокиселините в белтъците.

Съвременната молекулярна биология не може да се представи без полимеразния метод. верижна реакция(PCR). Благодарение на този метод се увеличава (амплифициране) броят на копията на определена ДНК последователност, за да се получи от една молекула достатъчно количество вещество за по-нататъшна работа с него. Подобен резултат се постига чрез технологията за молекулярно клониране, при която необходимата нуклеотидна последователност се въвежда в ДНК на бактерии (живи системи), след което размножаването на бактериите води до желания резултат. Този подход е технически много по-сложен, но позволява едновременно да се получи резултатът от експресията на изследваната нуклеотидна последователност.

Също така в молекулярно-биологичните изследвания се използват широко методи на ултрацентрофугиране (за разделяне на макромолекули (големи количества), клетки, органели), методи на електронна и флуоресцентна микроскопия, спектрофотометрични методи, рентгенов дифракционен анализ, авторадиография и др.

Благодарение на технологичния прогрес и научните изследвания в областта на химията, физиката, биологията и компютърните науки, модерното оборудване прави възможно изолирането, изследването и промяната на отделни гени и процесите, в които участват.

Молекулярна биология

наука, която има за цел да разбере природата на жизнените явления чрез изучаване на биологични обекти и системи на ниво, доближаващо се до молекулярното ниво, а в някои случаи достигайки тази граница. Крайната цел е да се установи как и до каква степен характерните прояви на живота, като наследственост, размножаване на себеподобните, биосинтеза на протеини, възбудимост, растеж и развитие, съхранение и предаване на информация, енергийни трансформации, мобилност и др. , се определят от структурата, свойствата и взаимодействието на молекулите на биологично важни вещества, предимно два основни класа високомолекулни биополимери (виж Биополимери) - протеини и нуклеинови киселини. Отличителна черта на M. b. - изследване на жизнени явления върху неодушевени обекти или такива, които се характеризират с най-примитивните прояви на живота. Това са биологични образувания от клетъчно нивои по-долу: субклетъчни органели, като изолирани клетъчни ядра, митохондрии, рибозоми, хромозоми, клетъчни мембрани; освен това - системи, които стоят на границата на живата и неживата природа - вируси, включително бактериофаги и завършващи с молекули основни компонентижива материя - нуклеинови киселини (Виж Нуклеинови киселини) и протеини (Виж Белтъци).

М. б. - нова областестествени науки, тясно свързани с отдавна установени области на изследване, които са обхванати от биохимия (вижте биохимия), биофизика (вижте биофизика) и биоорганична химия (вижте биоорганична химия). Разграничението тук е възможно само въз основа на отчитане на използваните методи и фундаменталния характер на използваните подходи.

Основата, върху която се развива M. b., е положена от такива науки като генетика, биохимия, физиология на елементарните процеси и др. неразривно свързан с молекулярната генетика (виж Молекулярна генетика) , която продължава да представлява важна част от математиката, въпреки че вече до голяма степен се е превърнала в самостоятелна дисциплина. Изолиране на M. b. от биохимията е продиктувано от следните съображения. Задачите на биохимията се свеждат главно до установяване участието на определени химически веществаза определени биологични функции и процеси и изясняване характера на техните трансформации; водещо значение има информацията за реактивността и основните характеристики химическа структура, изразяващо се с обичайното химична формула. По този начин по същество вниманието се фокусира върху трансформациите, засягащи основната валентност химически връзки. Междувременно, както подчерта Л. Полинг , в биологичните системи и проявленията на живота основното значение трябва да се отдава не на основните валентни връзки, действащи в рамките на една молекула, а на различни видове връзки, които определят междумолекулни взаимодействия (електростатични, ван дер ваалсови, водородни връзки и др.).

Крайният резултат от биохимично изследване може да бъде представен под формата на една или друга система химични уравнения, обикновено напълно изчерпани от изображението им в равнина, т.е. в две измерения. Отличителна черта на M. b. е нейната триизмерност. Същност на M. b. се вижда от M. Peruts за тълкуване на биологичните функции от гледна точка на молекулярната структура. Можем да кажем, че ако по-рано при изучаване на биологични обекти е било необходимо да се отговори на въпроса „какво“, т.е. какви вещества присъстват, и на въпроса „къде“, в кои тъкани и органи, тогава M. b. има за цел да получи отговори на въпроса „как”, като е научил същността на ролята и участието на цялата структура на молекулата, и на въпросите „защо” и „за какво”, като е разбрал, от една страна, връзките между свойствата на молекулата (отново преди всичко белтъци и нуклеинови киселини) и изпълняваните от нея функции и, от друга страна, ролята на тези отделни функции в цялостния комплекс от прояви на живота.

Относителното разположение на атомите и техните групи в обща структурамакромолекули, техните пространствени отношения. Това се отнася както за отделните компоненти, така и за цялостната конфигурация на молекулата като цяло. Именно в резултат на възникването на строго определена обемна структура биополимерните молекули придобиват тези свойства, благодарение на които са в състояние да служат като материална основа на биологичните функции. Този принцип на подход към изучаването на живите същества е най-характерната, типична черта на M. b.

Историческа справка.Огромната стойност на изследванията биологични проблемина молекулярно ниво, предвидено от I. P. Pavlov , който говори за последния етап в науката за живота - физиологията на живата молекула. Самият термин „М. б." Първо се използва английски. учен W. Astbury в приложение към изследвания относно изясняването на връзките между молекулярната структура и физическите и биологични свойства на фибриларни (влакнести) протеини, като колаген, кръвен фибрин или мускулни контрактилни протеини. Широко използвайте термина „М. б." стомана от началото на 50-те години. 20-ти век

Появата на M. b. Като зряла наука е прието да датира от 1953 г., когато Дж. Уотсън и Ф. Крик в Кеймбридж (Великобритания) откриват триизмерната структура на дезоксирибонуклеиновата киселина (ДНК). Това даде възможност да се говори за това как детайлите на тази структура определят биологичните функции на ДНК като материален носител на наследствена информация. По принцип тази роля на ДНК стана известна малко по-рано (1944 г.) в резултат на работата на американския генетик O. T. Avery и неговите колеги (виж Молекулярна генетика), но не беше известно до каква степен тази функция зависи от молекулярна структураДНК. Това стана възможно едва след като в лабораториите на W. L. Bragg (виж условието на Bragg-Wolff), J. Bernal и други бяха разработени нови принципи на рентгенов дифракционен анализ, което осигури използването на този метод за подробно познаване на пространствената структура на макромолекули на протеини и нуклеинови киселини.

Нива на молекулярна организация.През 1957 г. J. Kendrew установява триизмерната структура на миоглобин a , и през следващите години това беше направено от M. Perutz по отношение на хемоглобин а. Бяха формулирани идеи за различни нива на пространствена организация на макромолекулите. Първичната структура е последователността от отделни звена (мономери) във веригата на получената полимерна молекула. За протеините мономерите са аминокиселини , за нуклеинови киселини - Нуклеотиди. Линейна, нишковидна молекула на биополимер, в резултат на възникването на водородни връзки, има способността да се побира в пространството по определен начин, например в случай на протеини, както показа Л. Полинг, да придобие формата на спирала. Това се нарича вторична структура. За третична структура се говори, когато молекула с вторична структура се нагъва по един или друг начин, запълвайки триизмерното пространство. И накрая, молекулите с триизмерна структура могат да взаимодействат, естествено разположени в пространството една спрямо друга и образувайки това, което се нарича кватернерна структура; неговите отделни компоненти обикновено се наричат ​​подединици.

Най-очевидният пример за това как молекулярната триизмерна структура определя биологичните функции на една молекула е ДНК. Той има структурата на двойна спирала: две нишки, движещи се във взаимно противоположни посоки (антипаралелни), са усукани една около друга, образувайки двойна спирала с взаимно допълващо се разположение на основите, т.е. така че срещу определена основа на една верига има винаги една и съща в другата верига основата, която най-добре осигурява образуването на водородни връзки: аденин (А) образува двойка с тимин (Т), гуанин (G) с цитозин (С). Тази структура създава оптимални условия за най-важните биологични функции на ДНК: количественото умножаване на наследствената информация по време на процеса на клетъчно делене, като същевременно се поддържа качествената неизменност на този поток от генетична информация. При деленето на една клетка веригите на двойната спирала на ДНК, която служи като матрица или матрица, се развиват и върху всяка от тях под действието на ензими се синтезира комплементарна нова верига. В резултат на това от една майчина ДНК молекула се получават две напълно идентични дъщерни молекули (виж Клетка, Митоза).

Също така в случая с хемоглобина се оказа, че неговата биологична функция - способността обратимо да добавя кислород в белите дробове и след това да го предава на тъканите - е тясно свързана с характеристиките на триизмерната структура на хемоглобина и неговите промени в процес на изпълнение на присъщата му физиологична роля. Когато O2 се свързва и дисоциира, настъпват пространствени промени в конформацията на молекулата на хемоглобина, което води до промяна в афинитета на съдържащите се железни атоми към кислорода. Промените в размера на молекулата на хемоглобина, напомнящи промените в обема на гръдния кош по време на дишане, позволиха на хемоглобина да се нарече „молекулярни бели дробове“.

Един от най-важните характеристикиживи обекти - способността им да регулират фино всички прояви на жизнената дейност. Голям принос на M. b. V научни откритиятрябва да се счита за откриването на нов, неизвестен досега регулаторен механизъм, наричан алостеричен ефект. Тя се крие в способността на веществата с ниско молекулно тегло - т.нар. лиганди - модифицират специфичните биологични функции на макромолекулите, предимно каталитично действащи протеини - ензими, хемоглобин, рецепторни протеини, участващи в изграждането на биологични мембрани (вижте Биологични мембрани), в синаптичното предаване (вижте синапси) и др.

Три биотични потока.В светлината на идеите на М. b. съвкупността от жизнени явления може да се разглежда като резултат от комбинация от три потока: потокът на материята, който намира своя израз в явленията на метаболизма, т.е. асимилация и дисимилация; потокът от енергия, който е движещата сила за всички прояви на живота; и потока от информация, проникващ не само в цялото разнообразие от процеси на развитие и съществуване на всеки организъм, но и в непрекъсната поредица от последователни поколения. Именно идеята за потока от информация, въведена в доктрината за живия свят от развитието на биологичната наука, оставя своя специфичен, уникален отпечатък върху него.

Най-важните постижения на молекулярната биология.Скоростта, обхватът и дълбочината на въздействие на M. b. Напредъкът в разбирането на основните проблеми на изучаването на живата природа с право се сравнява например с влиянието на квантовата теория върху развитието на атомната физика. Две вътрешно свързани условия определят това революционно въздействие. От една страна, решаваща роля изигра откриването на възможността за изучаване на най-важните прояви на жизнената активност в най-прости условия, доближаващи се до вида на химичните и физичните експерименти. От друга страна, като следствие от това обстоятелство, имаше бързо включване на значителен брой представители точни науки- физици, химици, кристалографи, а след това и математици - в разработването на биологични проблеми. Взети заедно, тези обстоятелства определят необичайно бързия темп на развитие на медицинската наука и броя и значимостта на нейните успехи, постигнати само за две десетилетия. Ето далеч не пълен списък на тези постижения: откриване на структурата и механизма на биологичната функция на ДНК, всички видове РНК и рибозоми (виж Рибозоми) , разкриване на генетичния код (вижте генетичен код) ; откриване на обратна транскрипция (вижте Транскрипция) , т.е. синтез на ДНК върху матрица на РНК; изучаване на механизмите на функциониране на дихателните пигменти; откриване на триизмерна структура и нейната функционална роля в действието на ензимите (виж Ензими) , принцип на матричен синтез и механизми на биосинтеза на протеини; разкриване на структурата на вирусите (вижте вируси) и механизмите на тяхната репликация, първичната и отчасти пространствената структура на антителата; изолиране на отделни гени , химичен и след това биологичен (ензимен) синтез на ген, включително човешки, извън клетката (ин витро); трансфер на гени от един организъм в друг, включително човешки клетки; бързо напредващото дешифриране на химическата структура на нарастващ брой отделни протеини, главно ензими, както и нуклеинови киселини; откриване на явления на „самосглобяване“ на някои биологични обекти с нарастваща сложност, като се започне от молекулите на нуклеиновата киселина и се стигне до многокомпонентни ензими, вируси, рибозоми и др.; изясняване на алостеричните и други основни принципи на регулация на биологичните функции и процеси.

Редукционизъм и интеграция.М. б. е последният етап от тази посока в изучаването на живите обекти, която се обозначава като „редукционизъм“, т.е. желанието да се намалят сложните жизнени показателикъм явления, възникващи на ниво молекули и следователно достъпни за изучаване чрез методите на физиката и химията. Постигнато M. b. успехите показват ефективността на този подход. В същото време е необходимо да се има предвид, че в естествени условия в клетка, тъкан, орган и цял организъм имаме работа със системи с нарастваща сложност. Такива системи се формират от повече компоненти ниско нивочрез естественото им интегриране в цялост, придобиване на структурна и функционална организация и придобиване на нови свойства. Следователно, тъй като знанията за моделите, достъпни за разкриване на молекулярно и съседни нива, стават по-подробни, преди M. b. задачата за разбиране на механизмите на интеграция възниква като линия на по-нататъшно развитие в изучаването на жизнените явления. Отправна точка тук е изследването на силите на междумолекулните взаимодействия – водородни връзки, ван дер Ваалс, електростатични сили и др. По своята съвкупност и пространствено разположение те формират това, което може да се нарече „интегративна информация“. Тя трябва да се разглежда като една от основните части на вече споменатия поток от информация. В района на М. б. Примерите за интеграция включват феномена на самосглобяване на сложни образувания от смес от техните съставни части. Това включва например образуването на многокомпонентни протеини от техните субединици, образуването на вируси от техните съставни части - протеини и нуклеинова киселина, възстановяване на оригиналната структура на рибозомите след разделяне на техните протеинови и нуклеинови киселинни компоненти и др. на тези явления е пряко свързано с познаването на основните явления "разпознаване" на биополимерни молекули. Целта е да се установи какви комбинации от аминокиселини - в молекули на протеини или нуклеотиди - в нуклеиновите киселини взаимодействат помежду си по време на процесите на асоцииране на отделни молекули с образуването на комплекси със строго специфичен, предварително определен състав и структура. Те включват процесите на образуване на сложни протеини от техните субединици; освен това, селективно взаимодействие между молекулите на нуклеинова киселина, например транспорт и матрица (в този случай разкриването на генетичния код значително разшири нашата информация); накрая, това е образуването на много видове структури (например рибозоми, вируси, хромозоми), в които участват както протеини, така и нуклеинови киселини. Откриването на съответните закономерности, познаването на „езика“, лежащ в основата на тези взаимодействия, представлява една от най-важните области на математическата биология, която все още очаква своето развитие. Тази област се смята за един от фундаменталните проблеми за цялата биосфера.

Проблеми на молекулярната биология.Наред с посочените важни задачи на М. б. (познаване на законите на „разпознаването“, самосглобяването и интегрирането) спешна посока на научните изследвания в близко бъдеще е разработването на методи, които правят възможно дешифрирането на структурата, а след това и триизмерната, пространствена организация на високомолекулни нуклеинови киселини. Това вече е постигнато по отношение на общата схема на триизмерната структура на ДНК (двойна спирала), но без прецизно познаване на нейната първична структура. Бързият напредък в развитието на аналитичните методи ни позволява уверено да очакваме постигането на тези цели през следващите години. Тук, разбира се, основният принос идва от представители на сродните науки, преди всичко физиката и химията. всичко най-важните методи, чието използване осигури появата и успеха на микробиологията, са предложени и развити от физици (ултрацентрофугиране, рентгенов дифракционен анализ, електронна микроскопия, ядрено-магнитен резонанс и др.). Почти всички нови физични експериментални подходи (например използването на компютри, синхротронно или спирачно лъчение, лазерна технология и др.) разкриват нови възможности за задълбочено проучванепроблеми М. б. Сред най-важните практически проблеми, чийто отговор се очаква от M. b., на първо място е проблемът за молекулярната основа на злокачествения растеж, след това - начините за предотвратяване и може би преодоляване на наследствените заболявания - „молекулярни заболявания ” (Виж Молекулярни болести ). Изясняването на молекулярната основа на биологичната катализа, т.е. действието на ензимите, ще бъде от голямо значение. Сред най-важните съвременни тенденции в M. b. трябва да включва желанието да се дешифрират молекулярните механизми на действие на хормоните (виж Хормони) , токсични и лекарствени вещества, както и да разберете подробностите за молекулярната структура и функционирането на такива клетъчни структури като биологични мембрани, участващи в регулирането на процесите на проникване и транспортиране на вещества. По-далечни цели на М. б. - познаване на природата на нервните процеси, механизмите на паметта (виж Памет) и др. Един от важните нововъзникващи раздели на запаметяването. - т.нар генно инженерство, което има за цел да управлява целенасочено генетичния апарат (генома) на живите организми, от микроби и по-ниски (едноклетъчни) до хора (в последния случай, предимно с цел радикално лечение на наследствени заболявания (виж Наследствени болести) и корекция на генетични дефекти). По-мащабни намеси в човешката генетична основа могат да се обсъждат само в повече или по-малко далечно бъдеще, тъй като това ще включва сериозни пречки както от технически, така и от фундаментален характер. Във връзка с микроби, растения и евентуално селскостопански продукти. За животните такива перспективи са много обнадеждаващи (например получаване на сортове култивирани растения, които имат апарат за фиксиране на азот от въздуха и не изискват торове). Те се основават на вече постигнатите успехи: изолиране и синтез на гени, трансфер на гени от един организъм в друг, приложение популярни културиклетки като производители на икономически или медицински важни вещества.

Организация на изследванията по молекулярна биология. Бързо развитиеМ. б. доведе до появата на голям брой специализирани изследователски центрове. Броят им бързо расте. Най-големите: във Великобритания – Лаборатория по молекулярна биология в Кеймбридж, Кралски институт в Лондон; във Франция - институти по молекулярна биология в Париж, Марсилия, Страсбург, Институт Пастьор; в САЩ - отдели на M. b. в университети и институти в Бостън (Харвардски университет, Масачузетски технологичен институт), Сан Франциско (Бъркли), Лос Анджелис (Калифорнийски технологичен институт), Ню Йорк (Университет Рокфелер), здравни институти в Бетесда и др.; в Германия – Институтите Макс Планк, университетите в Гьотинген и Мюнхен; в Швеция - Karolinska Institutet в Стокхолм; в ГДР - Централният институт по молекулярна биология в Берлин, институти в Йена и Хале; в Унгария - Биологичен център в Сегед. В СССР, първият специализиран институт по медицина. е създадена в Москва през 1957 г. в системата на Академията на науките на СССР (вж. ); след това се формират: Институтът по биоорганична химия на Академията на науките на СССР в Москва, Институтът по протеин в Пущино, Биологичният отдел в Института за атомна енергия (Москва) и отделите на M. b. в институтите на Сибирския клон на Академията на науките в Новосибирск, Междуфакултетната лаборатория по биоорганична химия на Московския държавен университет, сектора (тогава Института) по молекулярна биология и генетика на Академията на науките на Украинската ССР в Киев; значителна работа по M. b. се извършва в Института за високомолекулни съединения в Ленинград, в редица отдели и лаборатории на Академията на науките на СССР и други отдели.

Наред с отделните изследователски центрове възникват организации от по-голям мащаб. Европейската организация за M. b. възниква в Западна Европа. (EMBO), в който участват над 10 държави. В СССР, в Института по молекулярна биология, през 1966 г. е създаден научен съвет по молекулярна биология, който е координиращ и организиращ център в тази област на знанието. Публикувал е обширна поредица от монографии върху най-важните раздели на литературата и редовно организира „ зимни училища» по микробиология, провеждат се конференции и симпозиуми по актуални проблеми на микробиологията. В бъдеще научните съвети относно M. b. са създадени в Академията на медицинските науки на СССР и много републикански академии на науките. От 1966 г. излиза списание Molecular Biology (6 броя годишно).

За сравнително кратък период от време в СССР израсна значителна група изследователи в областта на микробиологията; това са учени от по-старото поколение, които частично са прехвърлили интересите си от други области; в по-голямата си част това са множество млади изследователи. Сред водещите учени, взели активно участие във формирането и развитието на M. b. в СССР могат да се назоват А. А. Баев, А. Н. Белозерски, А. Е. Браунщайн, Ю. А. Овчинников, А. С. Спирин, М. М. Шемякин, В. А. Енгелхард. Нови постижения на M. b. и молекулярната генетика ще бъдат насърчавани от резолюцията на Централния комитет на КПСС и Съвета на министрите на СССР (май 1974 г.) „За мерките за ускоряване на развитието на молекулярната биология и молекулярната генетика и използването на техните постижения в националната икономика."

Лит.:Вагнер Р., Мичъл Г., Генетика и метаболизъм, прев. от англ., М., 1958; Szent-Gyorgy и A., Биоенергетика, прев. от англ., М., 1960; Анфинсен К., Молекулярна основа на еволюцията, прев. от англ., М., 1962; Стенли У., Валенс Е., Вирусите и природата на живота, прев. от англ., М., 1963; Молекулярна генетика, прев. с. Английски, част 1, М., 1964; Volkenshtein M.V., Молекули и живот. Въведение в молекулярната биофизика, М., 1965; Gaurowitz F., Химия и функции на протеините, прев. от англ., М., 1965; Bresler S.E., Въведение в молекулярната биология, 3-то издание, M. - L., 1973; Ingram V., Биосинтеза на макромолекули, прев. от англ., М., 1966; Енгелхард В. А., Молекулярна биология, в книгата: Развитие на биологията в СССР, М., 1967; Въведение в молекулярната биология, прев. от англ., М., 1967; Watson J., Молекулярна биология на гена, прев. от англ., М., 1967; Finean J., Биологични ултраструктури, прев. от англ., М., 1970; Бендал Дж., Мускули, молекули и движение, прев. от англ., М., 1970; Ичас М., Биологичен код, прев. от англ., М., 1971; Молекулярна биология на вирусите, М., 1971; Молекулярни основи на биосинтеза на протеини, М., 1971; Bernhard S., Структура и функция на ензимите, прев. от англ., М., 1971; Спирин А. С., Гаврилова Л. П., Рибозома, 2 изд., М., 1971; Frenkel-Konrath H., Химия и биология на вирусите, прев. от английски, М., 1972; Smith K., Hanewalt F., Молекулярна фотобиология. Процеси на инактивиране и възстановяване, прев. от английски, М., 1972; Харис Г., Основи на човешката биохимична генетика, прев. от английски, М., 1973.

В. А. Енгелхард.

Голям Съветска енциклопедия. - М.: Съветска енциклопедия. 1969-1978 .